1. 研究目的与意义（文献综述）

墨旱莲(EcliptaeHerba)为菊科一年生草本植物鳢肠EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，性寒，味甘、酸，具有凉血止血、滋阴益肾的功能，用于阴虚内热，血热妄行引起的吐血、衄血、咳血、尿血、崩漏出血、外伤出血及肝肾阴虚出现头晕目眩、牙齿松动、须发早白、腰痛筋软等。墨旱莲含有多种活性成分，如三萜皂苷类、黄酮类、噻吩类及香豆草醚类等，具有止血、保肝、免疫调节、抗炎、抗蛇毒、抗缺氧、抗氧化、抗衰老及保护心血管系统等多种药理活性。由于其强大的药用功效，已被中国药典收录。墨旱莲药用价值高，市场需求量大，在销售中出现了大量的掺假品和混伪品，而利用传统的鉴别方法较难鉴别真伪，直接影响到用药安全。目前鉴别墨旱莲掺假品和混伪品的方法多为物理辨别，如性状鉴别，观察其形状和闻气味居多；化学方法多为传统的鉴别方法，比如利用薄层色谱和紫外吸收光谱进行鉴别。本文利用DNA条形码技术对墨旱莲及其混伪品进行鉴定研究，简便、准确地鉴定墨旱莲药材及其易混淆品，对保障药材使用的有效性和安全性具有重要的意义。1、定义DNA条形码（DNAbarcode）是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。2、特点理想的DNAbarcoding应当符合下列标准：(1)具有足够的变异性以区分不同的物种，同时具有相对的保守性；(2)必须是一段标准的DNA区来尽可能鉴别不同的分类群；(3)目标DNA区应当包含足够的系统进化信息以定位物种在分类系统(科、属等)中的位置；(4)应该是高度保守的引物设计区以便于通用引物的设计；(5)目标DNA区应该足够的短以便于有部分降解的DNA的扩增…。DNAbarcoding作为生物“种水平species—level”鉴定的工具引人注目。Genbank数据库中COI序列正在快速增加。Min等分析了COI序列及其来源基因组核苷酸含量之间的关系，结果表明849个COI基因的5端的DNAbarcoding序列令人惊奇地准确地代表了其来源完整线粒体基因mtDNA的重要信息，也就是说对于未测序的基因组，从DNAbarcoding能快速预知完整基因组的组成。3、优点（1）以DNA序列为检测对象，其在个体发育过程中不会改变。同种生物不同生长时期的DNA序列信息是相同的。同种生物不同生长时期的DNA序列信息是相同的，即经过加工，形态发生变化，而DNA序列信息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本范围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。（2）可进行非专家物种鉴定。该技术是机械重复的，只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技术员即可操作。（3）准确性高。特定的物种具有特定的DNA序列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差。（4）通过建立DNA条形码数据库，可以一次性快速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将不断地加入数据库，成为永久性资料，从而推动分类学更加快速深入地发展。4、意义运用DNA条形码技术，就是通过使用一个或一些短的DNA基因片段作为条形码来对物种进行快速、准确识别的技术。DNA条形码技术的出现将极大地增强人类监测、了解和利用生物多样性资源的能力，其在生命科学、法医学、流行病学，以及医药、食品质量控制等领域均具有广泛的应用前景。DNA条形码技术不仅会进一步发展传统的分类学研究，更会加速微生物资源的保藏、鉴定工作，推动微生物资源的更有效利用。5、国内外研究现状2003年,Herbert研究发现利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(MitochondrialcytochromecoxidasesubunitⅠ,COⅠ)基因一段长度为648bp的片段能够在DNA水平上成功的区分物种,并且认为利用COⅠ基因从分子演化的角度,将提供一种快速、简便、可信的分类方法[3]。这种方法逐步发展起来并被研究者命名为DNA条形码技术。2003年于冷泉港召开的两个小型研讨会上,分类学、分子生物学和生物信息学的专家提出利用特定DNA序列实现物种鉴定的目标。2004年,由AlfredSloan基金会赞助,在美国华盛顿特区举办了一个关于DNA条形码的大型研讨会此次会议创立了“生命条形码联盟”(CBOL,theConsortiumfortheBarcodeofLife),大部分国家的自然历史博物馆、标本馆以及研究机构和私人机构等都加入了这个组织。DNA条形码技术的迅速发展吸引了研究者的广泛兴趣。2004年秋,美国国立生物技术信息中心(NCBI)与生命条形码联盟(CBOL)签署合作,物种条形码的标准DNA序列及其相关数据将存档GenBank。此前,Genbank虽然有很多医药和其他领域的团队在扩充数据,但是迄今为止,除了在系统发育研究上广泛应用的DNA分子标记外,从来没有与标准分类学相结合的DNA序列数据。200年2月,伦敦举办了第一届全球DNA条形码会议。大会对DNA条形码的分类概念与思想、实验技术的细节分析以及资料库建立等议题进行了讨论。目前,全球有很多个不同项目在不同的类群中进行,最终的目的是联合各个类群的DNA条形码数据库组建一个全球生物的DNA条形码数据库,此数据库将设置在Genbank中,是一个公众可以登陆的DNA序列数据库。

2. 研究的基本内容与方案

2.1研究的基本内容（1）提取墨旱莲及其混伪品的dna，获得dna条形码（2）比对dna条形码的异同，确定其真伪。2.2研究的目标通过提取墨旱莲和混伪品的dna，得到其dna条形码，来鉴别市面上的墨旱莲产品。2.3研究拟采用的技术方案及措施

2.3.1实验材料的收集

原材料墨旱莲及其混伪品的采集覆盖了湖北、广西等地的采集，每个植物样本采集达到3份以上，来自不同的产地。所有的原植物和药材均经过实验室老师的检验。

2.3.2墨旱莲及其混伪品dna提取1.取墨旱莲20-30mg,液氮或球磨仪于50hz下研磨120s.2.粉碎后加入800ul核分离液，充分混匀3分钟，7500rpm离心3min，去上清液，留沉淀，重复3遍。3.加入700ul65℃预热的gp1缓冲液（使用前先加入0.1%浓度的-巯基乙醇），迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃水浴2-3h(也可以在56℃在水浴过夜），水浴过程中颠倒离心管数次。4.加入700ul氯仿：异戊醇（24:1）充分混匀5min,在12000rpm离心5min，取上清液，重复此步骤一次。5.将上层水相转入新的离心管中，加入700ul预冷的-20℃异丙醇，混匀5min,-20冷却15-20min.6.将混匀的液体转入吸附柱cb3中，12000离心30s,弃掉废液（一次转不完，往往分两次）。7.向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(使用前加无水乙醇），12000离心30s.弃掉废液。8.加入700ul漂洗液pw（使用前加无水乙醇），12000rpm离心30s,弃废液，重复一次。9.12000rpm空管离心2min，弃掉废液，将吸附柱置于室温下放置20-30min左右，晾干漂洗液。（目的是除去乙醇，防止残留的乙醇影响后续的酶切和pcr反应）10.将吸附柱cb3转入干净的离心管中，向吸附柱中间位置悬空滴加50ulddh2o(ddh2o要提前预热），室温放置5min,12000rmp离心2min,将溶液收集到ep管中。11.将提取的dna原液放入冰箱-20度保存。(如果短时间内进行pcr扩增实验，则可放入4度保存）。注意：dna不宜频繁解冻。12.混伪品同上2.3.2引物的配置方法（1）引物母液的制备：将引物干粉在离心机里低速（7500rpm以下，如5000rpm）离心3min，按照干粉管上的指示，加入一定量的ddh2o，充分震摇混匀，再次放入离心机中低速（7500rpm以下，如5000rpm）离心3min。得到100um的引物母液。（2）2.5um引物（pcr常用）的制备：取100um的引物母液10ul，加入390ul的ddh2o，充分震摇混匀，放入离心机中低速（7500rpm以下，如5000rpm）离心3min，得到2.5um的引物。2.3.3dna提取试剂2*ctab的配制：(1)1mol/ltris.cl（ph8.0）：称取60.5gtrisbase，完全溶于无菌水后，用浓hcl调ph值至8.0，定容至500ml。(2)0.5mol/ledta（ph8.0）：称取93.06gedta.na2，完全溶于无菌水后，用naoh（约10g）调ph值至8.0，定容至500ml。(3)2×ctab抽提液：ctab10g，pvp10g，1mol/ltris.cl(ph8.0)50ml，0.5mol/ledta(ph8.0)20ml，nacl41g，定容至500ml。(4)3mol/lnaac（ph5.2）：称取40.8gnaac，将其完全溶于无菌水后，然后用冰醋酸将ph值调至5.2，最后定容为100ml。分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。(5)氯仿：异戊醇（24:1）：量取20ml异戊醇和480ml氯仿，混合为500ml。(6)te缓冲液：10mmol/ltris.cl（ph8.0），1mmol/ledta（ph8.0）r。(7)50×tae电泳缓冲液（ph约为8.0）：121gtrisbase，28.55ml冰醋酸，18.6gna2edta.2h2o，定容至500ml。（使用时稀释为1×工作液）2.3.4核分离液的制备核分成分 配1l量最终浓度1mol/ltris.cl（ph8.0）100ml100mm0.5mol/ledta（ph8.0）40ml 20mmnacl40.908g0.7mmpvp40 20g-巯基乙醇 20ml2.3.5pcr扩增测序设计并合成以上各组dna条形码通用引物，选择部分实验样本，分别运用不同引物片段配置不同pcr体系，并在不同的pcr扩增程序下对实验样本分别进行扩增，得到不同组的pcr产物。

3. 研究计划与安排

第1-2周：查阅相关文献资料，明确研究内容，了解研究所需的实验仪器和药品试剂。

确定方案，完成开题报告。

第3-12周：完成墨旱莲及其混伪品的搜集工作进行墨旱莲及其混伪品的dna提取、pcr扩增、测序比对墨旱莲和其混伪品的dna条形码，进行鉴定研究。

4. 参考文献（12篇以上）

[1]《中国药典》2015年版,第一部[2]陈士林,姚辉,宋经元,等.《基于DNAbarcoding(条形码)技术的中药材鉴定》［J］.世界科学技术-中医药现代化,2009,9(3):7-12.[3]黄泰康,《常用中药成分与药理手册》[M].北京：中国医药科技出版社,1994:1460.[4]陈士林,《中国药典中药材DNA条形码标准序列》[M],北京：科学出版社,2015年.[5]UtilityofthetrnH-psbAIntergenicSpacerRegionandItsCombinationsasPlantDNABarcodes:AMeta-Analysis.XiaohuiPang,ChangLiu,ShilinChen.PLoSOne.2012;7(11):e48833.[6]Genome-wideanalysisofsimplesequencerepeatsinthemodelmedicinalmushroomGanodermalucidum.JunQian,HaibinXu,ShilinChen.Gene.2012Oct13.[7]GenomesequenceofthemodelmedicinalmushroomGanodermalucidum.ShilinChen,JiangXu,ChangLiu,ect.NatCommun.2012Jun26;3:913.[8]吴淑荣,孔增科.《实用中药材鉴别手册》[M].天津：天津科学技术出版社,1990:2011.[9]陈士林,郭宝林,张贵君,等.《中药鉴定学新技术新方法研究进展》[J].中国中药杂志,2012,（8）37：1043.[10]侯典云,宋经元,石林春,等.《中药材锁阳的ITS2条形码分子鉴定研究》[J].中国中药杂志,2013,（23)38：4028.[11]陈士林.《中药DNA条形码分子鉴定》[M].北京：人民卫生出版社，2012:22.[12]陈士林,庞晓慧,姚辉,等.《中药DNA条形码鉴定体系及研究方向》[J].世界科学技术——中医药现代化,2011,（5）13：747.[13]陈士林,宋经元,姚辉.《药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析》[J].中国天然药物,2009,（5）7：322.[14]陈士林,姚辉,韩建萍,等.《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》[J].中国中药杂志,2013,38（2):141.[15]中国科学院中国植物志编委会《中国植物志》[M].北京：科学出版社,1987.