CHO-K1hERG稳定细胞系的建立开题报告

1. 研究目的与意义

人类的herg基因(human ether-a-go-go-related gene) 编码产物是一种电压门控式的钾离子通道。

herg基因是1994年由warmke等用小鼠eag(ether-a-go-go-related gene)基因同源染色体筛选人类海马cdna文库分离得到的,同年j ian g等通过候选基因定位法确定了herg 是先天性长qt综合征(long q2t symptom , lq ts) 的致病基因之一。

人们对herg 基因的关注源于其编码的钾离子通道,在心脏动作电位复极过程中发挥重要的作用。

2. 课题关键问题和重难点

本课题的主要难点有两点，首先第一点是在对于对转染条件的摸索，在已有的转染方法上如何找到最佳的转染条件，要对已有的转染方法进行优化，找到转染效率最高的方法。并用这种方法来进行转染细胞，在对转染得细胞进行加压培养，加压一周后来进行流式分选，分选出来的细胞在培养十到十五天。之后对长出来的单克隆进行检测，把信号好的进行扩大冻存。第二个难点在于检测的信号不够稳定，需要进行长期检测，最终才能筛到稳定的细胞系。

3. 国内外研究现状（文献综述）

在细胞培养实验中,细胞的状态是比较重要的，如何能培养出状态好的细胞对我们的下一步实验有非常重要的作用，在培养细胞的过程中，血清的处理和细胞的冻存这两方面的问题, 是较为复杂也是比较容易出错的。而血清处理和细胞冻存过程中的技术细节若处理不当, 会对细胞培养的效果产生较明显的影响。现代使用的合成培养基的成分和含量已经较为复杂,但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要。所以,在合成培养基中都要或多或少地加入一定比例的天然培养基加以补充。目前天然培养基多采用胎牛血清或小牛血清, 加入比例从百分之几到百分之几十不等。血清在细胞培养中的作用是十分重要的,从血清的保存和解冻和血清中的沉降物等方面了解了怎么把细胞的状态培养好，同时避免了自己会在这方面犯下小错误，导致培养的细胞状态不好。基因瞬时表达是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到染色体上，较短时间内就可获得基因的表达产物，但随着细胞的分裂增殖，这种外源基因最终会消失，其持续时间约为几天到两周。通常意义上所说的蛋白质表达多指稳定的基因表达技术。稳定的基因表达技术是生物生产系统的金标准；然而，其过程耗费了大量时间，不利于大通量、高效率地发现新的药用蛋白质。因此，基因瞬时表达方法为基因 - 蛋白质的研究提供了一种快速、方便的方法。相对于稳定的基因表达方法，基因瞬时（蛋白质）表达方法的优点有：微量至中等量的重组蛋白的生产过程大大缩短，还可以同时转染不同的细胞系，挑选出最为合适的细胞，同时用于难以实现稳定表达的重组蛋白质的生产，最后用于以细胞为基础的高通量筛选。瞬时基因表达技术常用的宿主细胞有 293 细胞、cos-7 细胞等，但是 cho（chinese hamster ovary，中国仓鼠卵巢细胞）细胞是目前重组蛋白药物的生产的首选体系；对于293细胞等表达系统的安全性尚缺乏足够的依据。cho 细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。所以我选择了cho-k1来构建稳定细胞系，并从中学习怎么优化转染条件来提高细胞转染的效率。最后人类的herg基因编码产物是一种电压门控式的钾离子通道。人们对herg 基因的关注源于其编码的钾离子通道,在心脏动作电位复极过程中发挥重要的作用。基因突变或药物引起该通道的功能异常可能会引起心脏q t 间期延长,进而可引起尖端扭转型室性心动过速(tdp) 、心室纤颤甚至猝死。tdp 是可以致命的,因此诱导tdp 的危险导致了药物的撤销和不被批准。herg钾通道已作为评价化合物潜在心脏毒性的分子靶标,进行候选化合物herg的安全性筛选,广泛用于新药研发的早期阶段,以有效地降低新药研发成本和风险。

【1】 李宇;崔长琮;赵永辉;薛小临;黄辰;张爱峰;;先天性长qt综合征相关herg基因细胞株的建立及其蛋白质表达[j];临床心血管病杂志;2007年02期

【2】邝素娟;林吉进;邓春玉;余细勇;单志新;杨敏;转染herg基因到hek293细胞及其通道电流的记录[a];国际心脏研究会（ishr）中国分会第十届暨中国病理生理学会心血管专业委员会第十三届学术会议论文摘要文集[c];2008年

4. 研究方案

第一步先做细胞的生长曲线，再知道细胞的生长规律之后，对细胞进行转染，转染用不同的转染方法进行转染，对比出转染效率高的方法。之后在进行加压筛选，持续一周左右，进行流式分选，培养十到十五天之后，对单克隆进行检测。在对信号好的进行持续检测，直到建立稳定的细胞系。

5. 工作计划

第 1-2周 在熟悉选题的基础上，依据选题的具体内容，开始转染细胞。

第 3-4 周 对已转染的细胞进行加压培养，加压约一周，从中挑选mixclone。

第 5-6周进行期中检查。