1. 研究目的与意义(文献综述)
大量研究表明[1-2],糖链的结构形态和变化与一些疾病的发生和发展密切相关,因此如何进行快速、有效的糖基结构分析是该领域研究的热点。糖基的主要检测方法有:电泳法、质谱法、核磁共振法、色谱法等。其中高效液相色谱-荧光检测法(lc-fd)以其分离效果好、灵敏度高等优点成为研究的热点之一。lc-fd的优点为:荧光检测器是目前灵敏度最高的检测器之一,检出限达10-12~10-13g·ml-1,灵敏度比紫外吸收检测器高100倍,同时操作简便快速,当要对痕量物质进行选择性检测时,它是一种有力的检测工具[3-5] 。
然而大多数糖类物质不含有生色团或荧光团,因此直接对糖类物质进行高灵敏度的检测比较困难。通常向糖链分子的还原末端引入荧光基团,将糖类物质标记上荧光基团,从而达到糖链的高灵敏度、高选择性分析。
香豆素类荧光化合物是对糖类分子进行荧光标记的有力工具。
2. 研究的基本内容与方案
(1)熟悉高效液相色谱-荧光检测器的操作及其注意事项,优化液相色谱分离条件
(2)衍生化反应
将制备的香豆素与糖基进行荧光衍生反应,测定产物荧光性质。
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将香豆素类化合物与糖基进行衍生;
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通过荧光检测,确定糖缀合物荧光衍生物的激发波长和发射波长λex/λem;
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利用质谱分析衍生前后溶液确定衍生产物;
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根据其衍生效率决定是否对糖标样进行定量分析。
衍生后产物利用LC-FD进行检测,测定其荧光量子产率[17-19]。
可优化分离参数采用的色谱柱: C18反相柱;
可优化分离参数:柱温度、流动相、洗脱方式;
如无特别说明分离条件,流速固定为:1 mL/min;荧光检测波长:上面测定值λex/λem;温度控制:35 ℃;进样量:20 μL;流动相A:乙腈,流动相B:水。
(3)在已有的优化条件下寻找合适的催化剂以优化衍生效率
| 香豆素 (1 mM) | 麦芽七糖 (0.2 mM) | 缓冲液 (0.2 mM) | 催化剂苯胺 (100 mM) | 水 |
空白样(μL) | 40 | 20 | 20 | 0 | 20 |
反应量(μL) | 40 | 20 | 20 | 20 | 0 |
以麦芽七糖(0.2 mM)为目标化合物,乙酸乙酸钠为缓冲液,在酸性条件下与下述的香豆素衍生物(a)、(b)以相应的反应摩尔比(香豆素/麦芽七糖)进行肟化反应,分别使用(1)~(5)的催化剂进行催化,在4 h的反应时间内,每隔20 min取5 μL反应液稀释10倍后,取20 μL进样,用LC-FD检测。
香豆素 | 温度(℃) | 摩尔比 | 反应时间(h) | pH | 催化剂量 |
(a) | 75 | 50:1 | 3.5 | 3 | 100:1 |
(b) | 80 | 600:1 | 3 | 3.5 | 5000:1 |
由于(2)~(4)的催化剂适用于中性条件下,所以我们可以选择不加入缓冲溶液进行反应。
通过LC-FD检测并计算其荧光吸收峰面积,通过不同时间采集的数据,作相关比较,在条件允许的情况下,再探寻其它有可能的高效催化剂。
3. 研究计划与安排
第 1- 2周: | 查阅相关文献资料,明确研究内容,了解研究所需试剂设备及实验进程。确定方案,完成开题报告。 |
第 3- 7周: | 针对不同的催化剂进行肟化反应。 |
第 8-11周: | 寻找高效的催化剂以及利用LC-FD法优化衍生效率。 |
第12-15周: | 综合分析所得数据,完成并修改毕业论文。 |
第16周: | 准备论文答辩。 |
4. 参考文献(12篇以上)
[1] 佟巍,基于化学衍生化的蛋白质n-糖链质谱鉴定新方法研究[d],中国人民解放军军事医学科学院.2012.
[2] 莫琳·e·泰勒,库尔特·德里卡默,糖生物学导论[m],化学工业出版社,2006.
[3] 叶宪曾,张新祥,仪器分析教程(第2版)[m],北京大学出版社,2009:351.
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