糖谱法比较分析不同种类及产地虫草多糖结构差异开题报告

文 献 综 述

1.植物多糖概述

1.1植物多糖的介绍

多糖在自然界中存在广泛，主要由10个及以上的单糖通过糖苷键连接而成。植物多糖具有多种重要的药理活性，在抗癌、抗氧化、抗衰老、降低血糖和提高免疫力等方面均有预防和治疗作用^[1]，而且具有较低的毒副作用，因此，多糖在多个领域被广泛地研究和应用。植物多糖的生物活性与它的结构密切相关，由于多糖的结构十分复杂，导致植物多糖的研究进展十分缓慢。

1.2植物多糖的研究水平

近年来，植物多糖的研究已经成为一个十分热门的领域。因为植物多糖具有十分重要及广泛的应用价值，所以对多糖结构的研究十分必要。随着植物多糖研究的不断发展，已经鉴定了许多天然植物多糖的结构^[2]。如表1所示是部分植物多糖的单糖组成信息、相对分子质量及药理作用。

表1 一些植物多糖的化学结构和生物活性

续表1

2.植物多糖的结构表征研究概述

2 .1. 植物多糖的提取

随着对植物多糖研究的深入，现已总结出了多种多糖的提取方法，除了传统的热水提取的方法以外，发现了更多实用、有效的提取方法，例如，超声波辅助提取、微波辅助提取、酶辅助提取以及酸碱提取法等^[11]。超声波辅助提取法大大缩短了提取时间，减少了能耗。此外超声波的剪切作用较强，长时间处理会使多糖的化学键断裂，降低多糖提取率。微波辅助提取法利用了微波穿透能力强和加热迅速的特点，提取的时间短，提取率高。微波提取的时间同样不宜过长，功率也不宜过高，否则将会导致过多的水分蒸发使多糖得率降低。酶辅助提取利用了酶反应的高度专一性，专一性的降解植物的细胞壁，从而释放植物多糖。酶提取法需要控制温度、PH等条件，且提取液中的酶不易分离。酸提取法是用适宜浓度的乙酸或

盐酸将含有酸性基团的多糖提取出来。碱提取法则是用弱碱将含有糖醛酸的多糖提取出来。酸碱提取法提取结束后都需要立即用碱或酸进行中和透析，否则会降低多糖的产率。此外，也有一些新的提取方法大大缩短了多糖的提取时间，提高了提取率^[2]。

提取的植物多糖中常常含有酚类物质使提取的多糖颜色加深，因此需要对其进行脱色，常用的脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法和吸附法。

2 .2.植物多糖的定量分析

多糖的含量测定方法包括比色法、滴定法、HPLC法及光谱法等。表2中描述了多糖的常用含量测定方法及其优缺点。

表2 多糖主要含有量测定方法及优缺点

2 .3. 植物多糖的单糖检测分析

在植物多糖的研究中，植物多糖的单糖研究是基础性和关键性的环节，植物多糖的单糖组成分析包括将多糖水解为单糖、单糖的分离、单糖的化学修饰及对单糖进行检测分析。单糖分子缺少发色基团，限制了单糖的检测分析，因此需要对单糖分子进行结构修饰。目前，

已有的单糖分子结构修饰技术包括3-甲基硅烷修饰技术、α-萘胺衍生化技术、糖腈乙酸酯衍

生化法、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生化法、1-

（4-异丙基）苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-(4-isopropyl) phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PPMP）修饰法、乙酸酐修饰法、2-氨基吖啶酮（2-amino acridone，AMAC）修饰法、苯并吖啶酮-5-乙酰肼（benzoacridinone-5-acetyl hydrazine，BAAH）衍生化法和邻苯氨基苯甲酸衍生化法^[16]。对单糖进行结构修饰之后有助于对植物多糖的单糖进行分析。植物多糖的单糖检测分析技术包括毛细管电泳技术、气相色谱技术、HPLC技术、质谱技术等^[16]。毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）技术的原理是利用处于电场中的带电粒子，在毛细管中的淌度或分配系数不同，从而进行高效、迅速分离。毛细管电泳样品用量少、时间短、灵敏度高、分离效果明显，分离带电荷的糖类具有独特优势^[17]。气相色谱技术（gas chromatography，GC）适用于测定样品含量较低的多糖组分，具有灵敏度高、结果可靠等优点。HPLC技术稳定性好，技术相对成熟，可操作性强，因此越来越多的单糖分离使用HPLC技术^[18]。质谱技术可以详细的解析化合物的结构特征，其原理是待测样品在离子源中电离形成荷质比不同的离子，利用电场和磁场的作用，使离子发生色散，从而得到MS图^[19]。

1～8.甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，岩藻糖。

图1 标准品中八种单糖的HPLC分离效果图

1～5.甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。

图2 葛仙米多糖水解样品衍生物的HPLC分离效果图

如图2所示是葛仙米多糖溶液水解、衍生之后，在检测条件下进行HPLC分离定性的单糖组成分析图。结果表明，葛仙米多糖中单糖的保留时间与与标准样品（图1）中甘露糖，葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的保留时间十分相似，可初步确定葛仙米多糖中的单糖组成^[25]。

2 .4.多糖的结构分析

多糖糖链结构分为一级结构和高级结构。糖链的一级结构包括单糖组成、残基间的连接方式和残基的构型等。结构分析的方法可分为三大类：化学分析法、生物分析法和仪器分析法。化学分析法主要用于分析单糖的组成、糖苷键的连接方式；生物分析法（酶降解法）主要用于分析二糖的组成和糖苷键的连接方式^[20]；仪器分析法的使用则更为广泛。甲基化分析法是分析多糖结构的重要手段，它在寡糖、多糖以及配体糖上糖链的单糖残基间连接位置的确定中应用广泛。目前甲基化的方法大多是在Hakomori法基础上改良的方法，改良之后的Hakomori使用无水二甲基亚砜为溶剂，使样品与强碱甲基亚磺酰钠反应，使多糖成为阴离子，游离的羟基离子化易与磺甲烷发生反应，多糖甲基化之后，发生水解、还原、乙酰化，最后

进行GC-MS分析。这种方法副作用小，结果准确^[20]。

2.5.多糖的分子量分布

多糖分子量分布是指多糖中不同分子量组分在总量中所占的分量。目前常采用的测定多糖分子量和分子量分布的方法为体积排阻色谱法，包括凝胶渗透色谱法（GPC）和高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）^[21]。GPC是根据不同分子量的多糖在色谱柱上与洗脱体积成一定关系的原理，首先用已知分子量的多糖绘制成标准曲线，然后根据样品的洗脱体积从标准曲线上求得多糖的分子量。HPGPC是根据不同分子量的多糖在凝胶柱上与保留时间（tR）成一定关系的原理，利用已知分子量的多糖绘制标准曲线，然后根据样品的保留时间（tR），从曲线中求得样品分子量^[21]。

2.6.糖谱法的应用

糖谱法包括高效分子排阻色谱法(HPSEC)、高效薄层色谱法(HPTLC)、荧光辅助凝胶电泳(PACE) 等色谱分析方法，能够对多糖进行定性分析和质量控制^[15]。PACE适用于高聚合度糖的分析，具有高分辨率和高通量的优点，用于分析多糖的水解产物；HPTLC适用于低聚合度糖和单糖的分析，具有简便快速、灵敏度高等特点。PACE和HPTLC进行组合可用于多糖水解特征的全面分析，HPTLC和PACE分析多糖衍生的单糖和寡糖的方法简单且高通量。因此，HPTLC和PACE的组合使用是全面了解多糖的酶水解和部分酸水解产物的一个不错的选择。使用基于HPTLC和PACE的糖分析法，对植物多糖多糖进行表征和比较，有助于更好地了解的结构特征，并改善其多糖的质量控制^[22]。如图3所示是用基于比折光指数增量值的 HPSEC-MALLS-RID 糖谱法测定混合多糖的含量及其比例, 利用多糖浓度与多糖比折光指数增量值的关联方程 Ci = α ( Vi－Vi baseline ) / ( dn / dc)计算多糖及其不同组分的含量(式中 α是示差折光检测器仪器常数，Vi和Vi baseline是多糖示差信号和基线信号，dn / dc 是多糖比折光指数增量)。结果表明HPSEC-MALLS-RID结合多糖通用dn/dc值

(0.15mLg^－1)测定不同混合多糖，能够准确测定混合多糖中不同组分的比例(图3)^[24]。研究表明，该方法在对中药活性多糖及其组份进行定量分析时，优势尤为突出。

图3 基于比折光指数增量值的HPSEC-MALLS-RID法测定混合多糖的含量及其比例

此外，采用基于HPSEC-MALLS-RID的糖谱法，可对多糖水解产物中的特征片段进行准确定量测定，实现对特定结构特征多糖的定量分析^[22]。

3.本课题研究的意义和主要内容

虽然植物多糖在自然界中广泛存在，在多种领域都具有应用价值。但是由于植物多糖结构复杂，至今对其研究还不够深入，当前对其结构研究还没有特别有效的方法，大多是采用仪器分析的方法获得部分信息。随着新科技的不断更新，开发植物多糖可采取不同的提取条件，且发明了新的纯化多糖的设备和材料，可提高多糖提取的效率，改善提取多糖的性状和提取纯化的工艺。本研究旨在应用糖谱法分析不同种类及产地虫草多糖的多元参数，如单糖组成、糖苷键类型、相对分子质量、粒径及高级构象表征，从而拓展其在多糖质量控制中的应用。

参考文献

[1]安晓娟，冯琳，宋红平等，植物多糖的结构分析及药理活性研究进展，中国药学杂志 2012 年 8 月第 47 卷第 16 期

[2]王如涛,吴绵斌,林建平等 ,植物多糖分离提取技术的研究进展, 中国生物工程杂志，2013，33(7) : 118-123

[3]ZHANG J,WU J,LIANG J Y,et al.Chemical characterization of Artemisiaseed polysaccharide [J].Carbohydr Polym,2007,67(5) : 213-218.

[4]LI S G,WANG D G,TIAN W,et al.Characterization and anti-tumor activity of a polysaccharide from Hedysarum polybotrys Hand.Mazz [J].Carbohydr Polym,2008,73(2): 344-350.

[5]GE Y,DUAN Y F,FANG G Z,et al.Polysaccharides from fruit calyx of Physalis alkekengi var.francheti:Isolation,puri cation, structural features and antioxidant activities [J].Carbohydr Polym.2009,77(2): 188-193.

[6]LI J E,NIE S P,YANG C,et al. Extraction optimization,charac-terization and bioactivity of crude polysaccharides from Herba Mo-slae [J].Carbohydr Polym,2011,83(3): 1201-1206.

[7]ZHAO LY,DONG YH,CHENGT,etal.Extraction,purication,characterization and antitumor activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum [J].Carbohydr Polym,2010,80(3):783-789.

[8]LI F,YUAN Q P,RASHID F.Isolation,puri cation and immuno-biological activity of a new water-soluble bee pollen polysaccharide from Crataegus pinnatida Bge[J].Carbohydr Polym,2009,78(1) : 80-88.

[9]LIXM,LIX,ZHOU AG.Evaluation of antioxidant activity of the polysaccharides extracted from Lycium barbarum fruits in vitro[J]. Eur Polym J,2007,43(2) : 488-497.

[10]LUO Q,LI Z,HUANG X,et al.Lycium barbarum polysaccharides:Protective effects against heat-induced damage of rat testes and H₂O₂-induced DNA damage in mouse testicular cells and bene cial effect on sexual behavior and reproductive function of hemicastrated rats [J]. Life Sci,2006,79(7) : 613-621.

[11]骆新峥,植物多糖的研究现状,质量技术监督研究,2010年第3期

[12]蔡凌云，肖德智，朱晓芳等．空心莲子草多糖定量测定比较[J]．中成药，2013,35(1): 207-209

[13]郑园园，童珊珊，徐希明等.药物分析技术在天然多糖质量控制中的应用[J]．江苏大学学报(医学版),2017,27(4):363-368．

[14]Xu J,Li S L,Yue RQ,et al.A novel and rapid HPGPC- based strategy for quality control of saccharide-dominant herbal materials:Dendrobium officinale,a case study [J].Anal Bioanal Chem,2014,406( 25) : 6409-6417.

[15]赵春霞，余河水,王春华等，中药中糖类定性及定量研究进展，中成药，2019年9月第41卷 第9期

[16]郭元享，张丽军，曹丽丽等.植物多糖中单糖组成分析技术的研究进展[J]。食品科学，2018, 39(1): 326-332.

[17]付昆,叶强.高效毛细管电泳法分析附子多糖中单糖组分[J].中国药业,2014,23(13): 17-19.

[18] BECKER M, ZWECKMAIR T, FORNECK A, et al. Evaluation of different derivatisation approaches for gas chromatographic-mass spectrometric analysis of carbohydrates in comple matri-

ces of biological and synthetic origin[J]. Journal of ChromatographyA,2013,1281:115-126.

[19] ACANSKI M M, VUJIC D N. Comparing sugar components of cereal and pseudocereal flourbyGC-MSanalysis[J].FoodChemistry,2014,145:743-748.

[20]刘丽丽,酸性多糖甲基化分析方法的改进,中国海洋大学(2014)

[21]封聚强,赵骏,中药多糖的分子量及结构研究进展, 1008-0805-(2008)03-0624-02

[22]李绍平，吴定涛，赵静等，糖谱及其在中药多糖质量控制中的应用,中国中药杂志 2015年9月 第40卷第17期

[23]杜清，许晓辉，林鹏程等，植物多糖的研究进展及开发前景,转化医学电子杂志, 2095-6894(2017) 04-78-05

[24] Cheong K L,Wu D T,Zhao J,et al. A rapid and accurate method for quantitative estimation of natural polysaccharides and their fractions using high performance size exclusion chromatography coupled with multi angle laser light scattering and refractive index detector［J］.J Chromatogr A,2015,1400: 98.

[25]莫开菊，赵娜，朱照武等，葛仙米多糖的单糖组成分析，食品科学，1002-6630（2015）18-0089-04