1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、选题的目的和意义：
珊瑚菜（glehnia littoralis fr. schmidt ex miq.）为伞形科珊瑚菜属多年生草本植物，以其干燥根入药，称为北沙参，味甘甜，属滋阴药，具有清肺化痰、养阴润燥、益胃生津的功效。野生珊瑚菜的主要分布区是沿海，对该地的防风固沙和改良盐碱土具有重要作用。但是由于近年来人们的过度开采，野生资源越来越少，面临着枯竭的危险。因此，当前国内市场销售的北沙参基本为栽培品，其主要产区是内蒙古地区，从珊瑚菜的生长发育环境可以推知，珊瑚菜具有优良的抗盐以及抗旱特性，但有关珊瑚菜抗盐机理的研究还不透彻，本课题主要针对与珊瑚菜抗盐机理相关的磷脂酶进行研究。
2、国内外研究现状：
2. 研究的基本内容和问题
1、研究的目标：
构建glnpc1蛋白表达载体；
3. 研究的方法与方案
1、研究方法
PCR扩增、测序比对、提取质粒、转化、小摇、大摇、提取纯化蛋白、测试四种底物的水解活性
2、技术路线图
3、实验方案：
（1）PCR扩增
上游引物序列：CCGATAACGC TGTACCTCGTAGTGCACATT CCTTTAACGC TTCAAAATCT GTAAAGCACG CCATATCGCC GAAAGGCACA CTTAATTATT AAGAGGTAATACACCATGAA TCACAAAGTG CATCATCATC ATCATCATAT CGAAGGTAGG CATATGGAGC TCGGTACCCTCGAGGGATCC GAATTC
下游引物序列：GAATTCAAGCT TGTCGACCTGCAGTCTAGAT AGGTAATCTC TGCTTAAAAG CACAGAATCT AAGATCCCTG CCATTTGGCG GGGATTTTTTTATTTGTTTT CAGGAAATAA ATAATCGATC GCGTAATAAA ATCTATTATT ATTTGAAGAA TACTGG
（2）测序比对
（3）提取质粒：提质粒，将PCR产物连接到质粒上并检验
（4）转化：先打好碎冰，在-70℃中取出感受态细胞（BL21表达用/DH5α克隆用），质粒1μl打入感受态细胞中轻打匀，在冰上放30min；
42℃水浴锅中热激1min30s；
热激后迅速放入冰上2min；
在无菌操作台上，每个管子里加入800微升的培养基LB（空培养基，不加抗生素，复苏用）；
37℃摇床复苏1h；
倒平板培养，倒一半即可，不要都涂，倒置封好，培养箱过夜；
将单菌落划板培养并进行PCR扩增验证
（5）小摇：
转化后菌用牙签接入20ml的加入氨苄抗生素（氨苄与卡纳母液都是50mg/ml，卡纳稀释1000倍用，氨苄稀释500倍用）的LB培养基，200转37℃摇床过夜；
准备好第二天要用的LB培养，配好灭菌；
（6）大摇：
大摇瓶加氨苄抗生素，1：50（1ml菌加入50ml培养基）用枪转移，200 rmp 37℃大概摇2h，取一毫升到圆头空管里，分光光度计测OD值为0.8—1左右，600纳米下，要稀释测，一毫升菌加两毫升水，稀释三倍，测出的OD值乘3即可。菌液加IPTG诱导，22℃摇床培养，摇6h，160 rmp；
收菌，50ml离心管离心5000g，5min；
（7）提取纯化蛋白
（8）蛋白电泳检验
（9）配置水解反应体系
（10）测试四种底物的水解活性
（11）超声破碎一分钟，将两相混合均匀后，分装在1.5ml的小管子中，做好标记，每管分别加入定量蛋白；
（12）提前将水浴锅调至37℃，将管子在水浴锅中加热避光反应；
（13）反应结束后放在冰上，每500μl酶液加入1000μl氯仿：甲醇=1；2（v/v），和750μl 0.45%的NaCl；
（14）离心12000g 5min，吸取下层有机相（含DAG），用氮气吹干，加入氯仿：甲醇=2：1 50μl每管；
（15）硅胶板烘干 30min，准备展层剂
A:石油醚：乙醚：乙酸=50：50：1
B：甲苯：氯仿：甲醇=85：15：5
C：正丁醇：乙醚：乙酸=70：30：1
（16）点样，跑薄层
（17）刮板子，过夜萃取
（18）用酶标仪测其活性
4、 可行性分析：
（1）实验所需要的PCR仪，超声破碎仪，离心机，IPTG诱导剂等试剂以及设备均具有；
（2）根据查阅的相关资料以及相关老师的指导，实验设计具有文献参考，方法合理因此可以开展此课题。
4. 研究创新点
特色或创新之处：
珊瑚非特异性磷脂酶c在参与响应盐胁迫过程，其在如何起作用是研究重点，而分析其水解活性是进行酶功能研究的基础，并能够丰富植物中磷脂酶c的研究。
5. 研究计划与进展
1、研究计划：
2019.7-9：
已知目的基因序列的情况下进行pcr扩增
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