扩展蛋白对高羊茅叶片伸长的影响开题报告

一、课题研究目的和意义

扩展蛋白是植物细胞壁的重要组成成分，是一类重要的功能蛋白，它可以疏松细胞壁，缓解细胞压力，对于植物的生长有重要作用，尤其对于植物根茎叶的伸长作用显著。植物中扩展蛋白家族成员众多，每个成员所承担的功能各不相同，因此，分析扩展蛋白不同家族成员在植物生长发育中的作用对于分子育种具有十分重要的意义。因此我们对高羊茅不同的扩展蛋白基因表达水平与多种处理条件下高羊茅叶片伸长速率之间的关系进行研究。

草坪草作为绿化不可或缺的植物，在生态体系中具有重要的地位，并且草坪草种质资源丰富，遗传背景多样，是开展扩展蛋白功能研究的优良材料。高羊茅是我国从国外引进的冷季型草种。高羊茅具有色泽深绿、叶片纤细、耐寒耐旱、苗期生长快等特点，无论是做牧草还是草坪草都有很高的利用价值。作为草坪草使用时，叶片特性为评价草坪草质量的重要指标，叶片的生长发育、伸长速率等因素对草坪整齐度、均一度、美观性等都有很重要的影响。已知扩展蛋白具有促进植物叶片伸长的功能，因此研究扩展蛋白与高羊茅叶片伸长的关系具有重大的现实意义。

二、研究概况

1.草坪草叶片长度研究

一般认为，凡是适宜建植草坪的都可以称为草坪草，但现代草坪主要用禾本科草，把用于建植草坪的禾本科草称为草坪草。草坪草是草坪的基本组成和功能单位，一般具有密生的特性，通常需配合修剪以保持表面平整。目前世界各地使用的草坪草有100多种，这些植物被人类选择出来，经过培育形成现代草坪植物的许多品。

草坪草大部分是禾本科草本植物，它们具有以下共同特点：草坪草叶多而小，细长且多直立。大多数草坪草为下繁草营养生长旺盛，营养体主要由叶组成。细小而密生的叶片有利于形成地毯状草坪。直立而细小的叶片有利于光线透射到草坪的下层叶片因而在高密度时下层叶片也很少发生黄化和枯死的现象。草坪草的绿色是草坪草最重要的特征之一，优良的草坪草应枝叶翠绿绿色均一且绿期长。草坪草地上部生长点低，并且有坚韧叶鞘的多重保护。这样修剪、滚压和践踏，对草坪草的危害小，利于分枝和不定根的生长，而且有利于越冬。草坪草多为低矮的根茎型、匍匐型或丛生型植物，具有旺盛的生命力和繁殖能力，除具备种子繁殖力外，还具备极强的无性繁殖能力。

叶片的长度是草坪草生长发育研究中尤为重要的一项内容。叶片的长度不仅影响光合作用，也影响产量。高羊茅既可作为草坪草，亦可作为牧草，叶片长度是作为牧草使用时衡量产量的重要指标。因此研究高羊茅叶片伸长机制有很重要的意义。

2.植物扩展蛋白功能研究

细胞伸长由细胞的可延展性决定，而扩展蛋白则是细胞壁上的一类重要的调控细胞延展性的蛋白(Cosgrove，1999)。在特定pH条件下，它可以通过打断细胞壁多糖之间的非共价键，导致细胞壁琉松，从而使壁上的多聚物在膨压驱动下蠕动(Cosgrove，2000)。扩展蛋白对于植物的生长有重要作用，尤其对于植物根茎叶的伸长作用显著。植物中扩展蛋白家族成员众多，每个成员所承担的功能各不相同，因此，分析扩展蛋白不同家族成员在植物生长发育中的作用对于分子育种具有十分重要的意义。

植物细胞壁为细胞生长发育提供必要的机械支撑，并保护细胞不受外界伤害。扩展蛋白是细胞生长的重要调节因子，密切参与了植物生长发育的各个阶段，包括种子萌发、根毛伸长、叶的形态建成以及叶柄脱落、花粉管伸长、果实成熟等。同时，当植物受到逆境胁迫时，扩展蛋自对植物具有保护作用(徐筱等，2010)。

越来越多的研究表明，扩展蛋白比大多数其他细胞壁上的生长发育蛋白和细胞壁疏松因子扮演了更多不同的角色(Cosgrove，1999，张安等，2013)。在水稻中，研究证明扩展蛋白基因的表达与节间生长相关，这与扩展蛋白促进植物生长的假说一致(Lee andKende，2002)。然而，尽管越来越多的证据表明扩展蛋自与植物的生长有密切关联，仍然有一些研究并不支持这种关系，显示出扩展蛋白的表达并不总是与植物生长相关(Caderas et al，2000，Rochange et al，2001)。一项关于草地羊茅(F. pratensis )的研究表明，虽然扩展蛋白基因在伸长中的叶片中有表达，但是表达水平并不与叶片伸长速度直接相关。这些扩展蛋白更倾向于与叶片的组织和器官分化相关，比如微管形成，分蘖发育(Reidyetal，2001)。除了器官伸长，扩展蛋白还可能与器官脱落、果实发育和种子萌发有关。

3.草坪草叶片伸长与扩展蛋白调控研究

草坪草作为城市绿化的重要物种，对其生理特性以及优良新品种的培育一直是草业工作者的重点。全世界草坪草的种类很多，多为一年生或多年生禾本科植物，较为常见的种属有早熟禾、翦股颖、高羊茅、结缕草、狗牙根等。高羊茅具有色泽深绿、叶片纤细、耐寒耐旱、苗期生长快等特点，也正因此，高羊茅草坪一向受到众多业内人士的推崇。研究扩展蛋白对高羊茅叶片伸长的影响具有重大的现实意义。

叶片伸长率(LER)是决定植物生长和产量的主要因素(Horst etal，1978)。叶片伸长受植物基因和发育情况的调节，随着植物叶片的年龄和位置的不同而不同。不同基因型的植物LER差异显著(Bultyncket al，2003)。由于生产目的的不同，在植物改良过程中，有时需要培育快速增长的品种，有时则要选择生长缓慢的品种。例如，对多年生草种而言，生长迅速是饲料牧草或天然草原的理想特性( Wang et al，2002 )，尤其是作为生物能源来开发(Brosse et al，2012)，而对于需要修剪的草坪而言，则需要选择生长缓慢的品种(Fagernessetal，2000。因此，了解控制叶片伸长的机制，对遗传改良和分子育种至关重要。

LER由细胞伸长和细胞分裂两个方面决定(Green，1976)。而细胞的伸长和分裂均是在叶片伸长区发生，这个区域位于叶片基部，被包裹在老叶片的叶鞘内(Volenecand Nelson，1981)。有些植物中，品种间LER的差异是由细胞伸长和分裂两个方面共同决定，如高羊茅(MacAdam et al，1989)。Volenec 等人(1981)发现，在高LER型的高羊茅中表皮细胞长度(26 mn/d)比低LER型的高羊茅品种(18 mm/d)长约25%，而细胞产生速率则高出约24%。这说明不同基因型间LER的差异既与细胞长度有关，也受到细胞产生速率的影响。但在有些物种中，种间LER的差异并不影响植物的细胞大小，而仅仅与细胞产生速率有关，如早熟禾(Fiorani et al，2000)和山羊草(Aegilops) (Bultyncketal， 2003)。

已有研究表明，高羊茅不同基因型植株叶片伸长速率差异显著，而叶片伸长速率的差异与叶片细胞的伸长和分裂密切相关。研究表明，不同高羊茅品种生长速率的差异与表皮细胞的长度和生成速率均相关。

研究表明，扩展蛋白可通过改变分生组织的生物物理应力模式影响植物叶片的形态发生。禾草类叶片在伸长过程中，常常表现出不同叶片区段相对伸长速率不同的现象，叶片顶端是相对成熟的，并不参与叶片伸长。而且，在伸长区的不同位置，叶片相对伸长速率并不相同。研究表明，某些扩展蛋白的表达量与叶片上不同区段的伸长速率呈正相关。

研究表明，禾草类叶片在伸长过程中，常常表现出不同叶片区段相对伸长速率不同的现象，比如，正在快速生长的玉米叶片，其伸长区只有叶片基部大约80mm，叶片顶端是相对成熟的，并不参与叶片伸长:而且，在伸长区的不同位置，叶片相对伸长速率并不相同，通常从基部开始，伸长速率逐渐增加，到20 mm至30 mm之间达到最大值，之后逐渐下降直至为零。研究表明，某些扩展蛋白的表达量与叶片上不同区段的伸长速率呈正相关，比如ZmEXPA4，ZmEXP49和ZmEXPB2 (Muller et al，2007)。Goh等人于2012年研究发现，利用小RNA技术抑制拟南芥中某些扩展蛋白基因(EXP4I、EXP43、EXPA5、 EXPA10) 的表达会导致叶片伸长受阻(Hoe-Han et al，2012)。

三、应用前景

1.植物扩展蛋白基因研究前景

扩展蛋白作为植物细胞壁的重要组成成分，其主要作用方式是疏松植物细胞壁的组分，增加细胞壁的柔韧性，这一特征决定它参与了植物细胞生命活动的许多过程。近些年来，随着抗逆性分子生物学研究的深入，陆续发现其在耐热、抗旱、抗病等抵御逆境方面也起着非常重要的作用。当植物处于逆境胁迫时，通过细胞壁中扩展蛋白的积累，疏松细胞壁的组分，增加细胞壁的柔韧性，可以舒缓 逆境造成的压力，维持细胞的基本形态。植物这种被动式的抵御逆境胁迫的现象不仅为扩展蛋白的功能赋予了更多的新含义，也为抗逆的分子生物学研究开辟了新思路。相信随着对扩展蛋白作用机制研究的探索和深入，将有可能为植物生长发育新的理论依据，会有更多扩展蛋白的功能被发现并被应用到实践当中。

2.草坪草叶片伸长相关扩展蛋白基因研究前景

通过对高羊茅中叶片伸长相关扩展蛋白基因的表达水平进行了多角度的考察，鉴定出与高羊茅叶片伸长密切相关的扩展蛋白基因，并进一步测定基因在叶片不同部位的表达水平，确定不同品种中调控叶片不同部位伸长速率的相关基因，克隆其启动子，对上游元件进行分析，确定扩展蛋白对高羊茅叶片生长的调控机制。为未来草坪草生长发育的研究提供了思路，也为未来草坪草抗逆等特性的研究提供了理论基础。

参考文献：

[1]徐倩. 草坪草耐热及叶片伸长相关扩展蛋白基因的克隆和功能研究[C]. 北京林业大学，2016.

[2]韩阳阳，王天晓，等. 扩展蛋白与激素调控的生长发育[J].生命的化学，2015(06).

[3]徐筱，徐倩，等. 植物扩展蛋白基因的研究进展[J]. 北京林业大学学报，2010(05).

[4]赵美荣，李永春，等. 扩展蛋白与植物抗逆性关系研究进展[J]. 植物生理学报[J]，2012(07).

[5]王玮，赵新西，马千全，等. 扩展蛋白生理与分子生物学[J]. 植物生理学通讯，2004，40(1) :1-6.

[6]孙涌栋，罗未蓉，张传来. 扩展蛋白家族蛋白序列分析[J]. 生物信息学，2009，7(3):193-195.

[7]高英，王学臣. 扩展蛋白研究进展[J]. 中国农学通报，2005，21(7):82-86.

[8]黄龙翔，牛向丽，等. 水稻延伸蛋白基因OsEXPB7干涉载体的构建、遗传转化与基因功能分析[J].应用与环境生物学报，2013(02).

[9]逯晓萍，云锦凤，等. 高丹草株高与叶片数主基因 多基因的遗传分析[J]. 草地学报，2009(06).

[10]周姗.小麦叶片伸长生长对干旱胁迫的响应与扩展蛋白关系研究[C].山东农业大学.

[11]王玉倩，薛秀花. 实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J]. 生物学通报，2016(02).

[12]马月萍，戴思兰. 荧光定量PCR技术在植物研究中的应用[J].生物技术通报，2011(07).

[13]Ying CUI，Jin JIA.Application of Real-time Fluorescent Quantitative PCR in Plant[J].Molecular Biology and Tissue Culture，2016，17(2).

[14]MULLIS KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction [J]. Scientific American， 1990， 262: 56-61.

[15]WANG YH ，ZHAO S . Estimation of the copy number of exogenous gene in trans-genic rice by real-time fluorescence quantitative PCR [J]. Life Science Research，2007，11 (4): 301 -305.

[16]Arredondo JT，Schnyder H. Components of leaf elongation rate and their relationship to specificleaf area in contrasting grasses[J]. New Phytologist，2003， 158(2): 305-314.

一、研究目标

本实验在扩展蛋白调控植物生长发育研究进展的基础上，运用实时荧光定量PCR技术原理和测定方法，对高羊茅不同的扩展蛋白基因表达水平与多种处理条件下高羊茅叶片伸长速率之间的关系进行研究，以期为扩展蛋白基因调控草坪草生长发育机理研究实验提供更便捷直观的理论依据。

二、研究内容

1.筛选叶片伸长速率不同的高羊茅品种；

2.高羊茅扩展蛋白基因家族在不同品种中的表达，并将其与叶片伸长速率进行关联分析，筛选与叶片伸长相关的候选基因；

3.候选基因在叶片不同生长区段的表达；

4.逆境胁迫对不同区段扩展蛋白表达的影响；

三、拟解决的关键问题

1.筛选出高羊茅叶片扩展蛋白家族中调控叶片伸长的基因；

2.测定叶片不同区段生长速率，探究叶片扩展蛋白调控叶片伸长的基因表达部位。

一、研究方法

1.筛选具有不同叶片伸长速率的高羊茅品种

（1）根据株高获得株高较高及较低的高羊茅材料各10份；

（2）定株测其生长生长速率（每两天测一次，根据线性生长方程得到生长速率）；

（3）对不同品种株高及生长速率进行关联分析；

2.高羊茅扩展蛋白基因家族在不同品种中的表达，并将其与叶片伸长速率进行关联分析，筛选与叶片伸长相关的候选基因；

（1）根据已报道的水稻的扩展蛋白序列，在高羊茅cDNA数据库中进行blast搜索，得到高羊茅扩展蛋白家族基因共22个，9个α亚族，13个β亚族基因；

（2）根据http://primer3.ut.ee/ 网站设计引物，利用实时荧光定量PCR测定不同基因在不同材料中的表达；

（3）将基因表达与叶片伸长速率进行关联分析，筛选强相关及中等相关的基因；

3.叶片不同区段的基因表达，确定扩展蛋白的作用

（1）采用小孔法测定叶片相对生长率的空间分布：直径0.25mm的细针穿过外层叶片的叶鞘给叶片打孔，第一个孔离叶子最基部2mm；24h后，将第三片叶子外层的叶片剥去，露出第三片叶子上的针孔，固定在体视显微镜下观察。使用照相机记录第三片叶子上的孔的最终位置。叶片的相对生长率(REGR, mm mm-'h')按照以下公式进行计算： REGR=(df-di）/(di*△t)， df 和di是叶片上两个针孔间的最终距离和初始距离，△t是从打孔到观察之间的时间。

（2）根据不同伸长速率分区段取样，测定其基因表达水平；

4.逆境胁迫对不同区段扩展蛋白表达的影响；

（1）对不同材料进行干旱、盐等胁迫处理；

（2）分区段测其基因表达。

二、技术路线

三、可行性分析

本实验对高羊茅叶片伸长速率，叶片扩展蛋白基因表达水平，以及高羊茅叶片的不同区段生长速率等指标进行测定，为植物生理研究常用方法，且实验室多年来从事相关研究，积累了丰富的经验。指导教师所在课题组在前期研究工作中，已对高羊茅有了深入的了解，所需仪器设备为本院实验中心的专门设备，测定技术和方法可靠。本实验的可操作性很强，一部分实验材料已具备，有专业的老师指导，提供帮助。因此，本研究的研究方案和研究方法完全可行。

对于扩展蛋白的序列和功能研究，目前主要集中在农作物和经济作物中，涉及的性状多与植物的生长发育有关。在草坪草领域研究扩展蛋白调控叶片伸长的研究尚且不多。作为绿化不可或缺的植物，草坪草在生态体系中具有重要的地位，并且草坪草种质资源丰富，遗传背景多样，是开展扩展蛋白功能研究的优良材料。因此该项研究具有广阔的应用前景，也为其他扩展蛋白调控草坪草生长发育的其他相关研究提供了理论依据。

一、研究计划

2018年4月—2018年6月 筛选出叶片伸长速率不同的高羊茅品种；

2018年7月—2018年9月 获得高羊茅扩展蛋白基因家族信息，完成基因表达水平测定；

2018年10月—2018年12月 完成不同区段伸长速率的测定及基因表达分析；

2019年1月—2019年3月 进行逆境处理，完成不同区段的基因表达；

2019年4-月—2019年5月 撰写论文。

二、预期进展

1.完成高羊茅叶片伸长速率，叶片扩展蛋白基因表达水平，以及高羊茅叶片的不同区段生长速率等指标的测定；

2.初步确定出调控高羊茅叶片伸长的扩展蛋白基因；

3.发表论文1－2篇。