1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| HPR即HYDROXYPYRUVATEREDUCTASE，编码羟丙酮酸还原酶，在拟南芥中只有一个单基因(At1g68010)编码HPR蛋白[1]，在免疫电镜下它特定地位于过氧化物酶体[2]。过氧化物酶体是单膜结合的、小的细胞器，存在于几乎所有真核细胞中[3]，容纳了大量代谢和发育的氧化反应，这些细胞器在自然界是动态的，为了响应发育和环境的变化，适应机制需求，它们的数量、形态和蛋白组成都能被重新编辑。植物细胞中过氧化物酶体的主要功能有光呼吸循环、脂肪酸β氧化、乙醛酸循环、酰脲代谢、相关代谢物、解除活性氧、植物特定功能包括光呼吸和JA、生长素等激素代谢[4]。 1．过氧化物酶体的功能和作用 1.1过氧化物酶体能够产生和清除不同的ROS ROS的种类繁多，如自由基化合物:超氧阴离子自由基(O2-)、羟自由基(-OH)、烷氧自由基(RO-)和脂质过氧化自由基(ROO-);以及非自由基化合物:过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)、臭氧(O3)和次氯酸(HOCl－)等[5]。ROS有不同来源，其中过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2－)、羟基自由基(-OH)和单线态氧(1O2)，可以在过氧化物酶体中产生。植物过氧化物酶体含有酶防御系统，能够应对不同类型的活性氧[6]。 1.2过氧化物酶体在维持细胞的氧化还原动态平衡中发挥重要作用 在过氧化物酶体中含有参与产生和降解ROS的多种酶，可以调节细胞的氧化还原平衡。ASC-GSH循环是重要的非酶细胞的氧化还原缓冲系统。可在叶绿体、细胞质和线粒体中发生，近来研究表明也可在过氧化物酶体中发生。 1.3过氧化物酶体在胁迫条件下和发育期间能调控细胞应答 Vanderauwera等[7-8]利用过氧化氢酶的功能缺陷突变体将过氧化物酶体中的H2O2转录组数据进行分析，表明许多基因能够被H2O2调控。大多数的修饰与生物和非生物胁迫应答有关，H2O2诱导蛋白质的亚细胞定位分析指出细胞核与细胞质可作为靶目标与一些转录因子或核酸结合相关。 1.4过氧化物酶体是细胞内ROS水平变化的感应器 |
细胞器的运动对维持细胞功能来说是必需的，其中包括细胞器和信号之间的交叉通信[9]。过氧化物酶体是一种高度动态的细胞器，在臭氧、光、生物异源物质、盐和金属胁迫条件下，其数量增加，这个过程被称为增殖诱导[10-11]。高光诱导ROS和增加过氧化物-线粒体相互作用。管状过氧化物酶体开始收缩，并最终经历裂变以增加过氧化物酶体的数量[12]。
过氧化物酶体对植物的每个发展阶段都很重要，从胚胎、种子、营养和生殖生长，到衰老，也包括植物响应外界自然环境。在自然界白天、黑暗循环中，植物的生长、发育和代谢都是受动态调控的，除了CO2、养分和水之外，光是最重要的环境因子。光是植物生长和发育必不可少的环境因子之一，对植物的生长发育、形态建成、光合作用、物质代谢以及基因表达均有调控作用[13]。而光合作用既是植物物质生产的重要生理生化过程，也是碳循环的关键环节［14］。光合作用会在光照、温度、水分、CO2浓度等环境因子的变化下进行调节［15－18］。光照条件不仅影响植物的光合速率、气孔导度等［19］，也会对光合特性产生影响，通常用光合参数表征植物的光合特性。有研究表明，植物的光合生理特性在一定程度上能够体现其对生境的响应情况［20］。不同植物以及同种植物在生长的不同阶段对光的需求不同，对不同光环境的响应与适应特性也存在差异［21］。为了适应不同光环境，植物不仅在形态上产生相应改变，在叶绿素含量、光补偿点、光饱和点、暗呼吸、光合能力等生理生态特征上也发生相应的变化［22－25］。
因此，研究植物体内的过氧化物酶体对光环境的响应有着重要意义，而国内外目前对这方面的研究及其有限，过氧化物酶体与光环境内部的联系仍然是处于状态，通过拟南芥这种理想的植物材料，也为揭示其他植物的机理提供借鉴。
参考文献
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2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
本研究致力于从基因型和RNA表达水平两个方面鉴定hpr突变体，从分子层面探究hpr突变体对高光和变光这两种光环境下的叶绿素荧光指标。
2.研究内容
2.1 hpr突变体基因型鉴定
2.2 hpr突变体RNA表达水平
2.3高光下hpr突变体的表型及光合作用
2.4变光下hpr突变体的表型及光合作用
3.拟解决的关键问题
| 拟南芥作为一种模式植物，以其基因组小、生长周期短等优点作为广泛的研究对象，探究拟南芥过氧化物酶体对光环境的响应，对揭示植物在适应光信号有很高的价值，也为极大地为其他植物提供了参考。 |
3. 研究的方法与方案
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1. 研究方法 1.1 hpr突变体基因型鉴定 拟南芥叶片抽DNA，设计引物，PCR扩增片段，观察电泳结果。 1.2 hpr突变体RNA表达水平 拟南芥叶片抽RNA，反转录成cDNA，进行Real time PCR。 1.3 高光及变光下hpr突变体的表型及光合作用 野生型和突变体在生长箱中处理一周左右，直到观察到突变体和野生型出现表型差异，测量叶绿素荧光、鲜重和叶绿素浓度，观察叶绿体中的复合体结构。 （1） 叶绿素荧光参数 利用封闭式叶绿素荧光仪测定 （2） 叶绿素浓度 取拟南芥叶片，加丙酮后在37°恒温箱中过夜后，用超微量分光光度计测量浓度。 （3） 叶绿体中的复合体结构 做BN-PAGE，观察叶绿体中的复合体结构。
2. 技术路线
3. 实验方案
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3.1实验材料
拟南芥
3.2实验设计
实验于2018年10月~2019年5月在武汉大学生命科学学院侯昕教授实验室，采用盆栽方式进行。温室、高光、变光三种水平，野生型、突变体两个品种，皿栽、盆栽两个处理。
3.3实验方法
拟南芥点种后，在4°冰箱春化两天，温室生长一周萌发后，分别移至皿里和土里。置于温室和生长箱中，每两天浇一次水，待突变体出现表型差异后开始测量叶绿素荧光。
3.3样品采集
在拟南芥生长三周后取地上部分，用于后续实验。
3.4数据处理
实验数据采用EXCEL2007进行统计。
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4. 可行性分析 武汉大学生命科学学院侯昕教授实验室属于杂交水稻国家重点实验室，可以提供与拟南芥光合作用相关的所有仪器与指导。 |
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4. 研究创新点
关于拟南芥中的过氧化物酶体，已知的研究都是围绕着重金属胁迫与干旱胁迫等非生物胁迫下的氧化还原反应，对于过氧化物酶体如何响应光环境仍是未知的，所以对于拟南芥HPR突变体在不同光环境下光合指标的变化以及叶绿体中的复合体结构都是需要去探索的。
5. 研究计划与进展
2018年11月-2018年12月 拟南芥hpr突变体鉴定（已完成）
2019年12月-2019年1月 高光处理
2019年1月-2019年2月 光合作用测定
2019年2月-2019年3月 变光处理
2019年3月-2019年4月 光合作用测定
| 2019年4月-2019年5月 数据处理、论文撰写及结题。 |
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