蚂蟥冬眠期间细胞凋亡与自噬相关基因表达的研究开题报告

1. 研究目的与意义

研究意义

蚂蟥whitmania pigra whitman是中药材水蛭的主要基原动物^[1]，又称宽体金线蛭^[2]，具有破血通经，逐痕消瘾的作用。用于血癖经闭，撤瘤痞块，中风偏瘫，跌扑损伤^[1]。蚂蟥中水蛭素是目前鉴定出的最强的凝血酶特异性抑制剂^[3]。随着市场对药材水蛭的需求急剧增加，以及环境污染的日益加重，导致了蚂蟥野生资源几近枯竭。虽然近年来蚂蟥的人工养殖已经取得了初步成功，南京农业大学中药材研究所从20世纪90年代中期便开始了对水蛭的人工驯化及养殖的研究。目前人工繁育和养殖蚂蜡已基本获得成功^[4]，对其生理特性等方面的研究也逐渐深入，但是对于蚂蟥冬眠期间细胞自噬和细胞凋亡的机制的研究还未见报道。本实验通过对不同阶段冬眠蚂蟥细胞自噬和细胞凋亡相关基因的表达的研究，来揭示冬眠期间蚂蟥的细胞自噬和细胞凋亡的调控机制，为进一步的研究和应用提供理论依据和科学指导。

国内外研究概况

2. 研究内容和预期目标

研究目标：

研究蚂蟥冬眠期间细胞自噬和凋亡机制。为研究蚂蟥冬眠期间细胞自噬和凋亡调控奠定基础和科学依据。

研究内容：

3. 研究的方法与步骤

研究方法：

采用荧光定量PCR，和western blot技术，进行蚂蟥冬眠期间相关基因表达的研究。

技术路线：（详情见附件）

实验方案：

实验材料处理

选取健康蚂蟥活体材料进行5组处理，分别为正常组、进入冬眠组、冬眠组、出冬眠组、正常组。

一、western blot试剂盒检测AMPK

1.组织中总蛋白的提取

（1）解剖蚂蟥取消化道0.1g3迅速放入液氮中速冻。

（2）取速冻后的蚂蟥消化道充分研磨成粉末状，收集到1.5mlEP管，加入1mL含有足量蛋白酶抑制剂的RIPA buffer（10ul蛋白酶抑制剂混合物 990ul RIPA buffer），冰上裂解30min，期间研磨搅拌2-3次（或用匀浆机匀浆至组织充分分解）。

（3）12000 r/min，4℃，离心10 min，取上清液，按照比例加入5倍loading buffer

2.蛋白含量的测定

（1）从-20℃取出牛血清蛋白BSA，取0.1g蒸馏水定容至100ml，即1 mg/ml （2）取1.5 ml离心管，3个一组，分别标记为0，1，2，3，4，5，6，7（7为样本）

（3）按下表在各管中加入各种试剂。

（4）各管充分混匀后，37℃放置30 min，然后在562nm下比色测定，以蛋白质含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

（5）以标准曲线0号管为参照，在562nm波长下测量待测样品的吸光值。

（6）根据所测样品吸光值，计算出样品蛋白的实际浓度。

3.凝胶的制备

（1）根据蛋白的分子量按比例配制分离胶，轻缓摇动混匀，不要过于剧烈以免混入过多氧气。待凝胶溶液混合均匀，将凝胶溶液平缓注入两层玻璃板中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气接触凝胶溶液影响凝胶的聚合，保持水平，在37℃恒温箱中静置约1小时，直至凝胶溶液完全聚合凝固。

（2）按比例配制浓缩胶，轻缓摇动混匀，滤纸吸去已凝固分离胶上的水，平缓注入浓缩胶溶液，小心插入梳子，并注意齿尖不可有气泡。在37℃恒温箱中静置约1h，直至凝胶溶液完全聚合凝固，小心拔出梳子，准备上样。

4.上样

向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。玻璃板内侧液面高于外侧。然后开始上样(已处理好的样品，组织和细胞阳性对照蛋白样本和阳性对照重组蛋白，彩色蛋白预染Marker )，保证每孔总蛋白量在30-50ug，总上样量小于30ul，注意上样时间尽量短，避免样品扩散。

5.电泳

上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压（建议70-80v）要低于分离胶电泳电压（建议90-110v），以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。电泳直至澳酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3小时。

6.染胶

电泳完毕可通过使用凝胶蛋白质蓝染试剂 ,凝胶蛋白质快速蓝染试剂，蛋白质银染检测试剂检测电泳是否成功。染胶只用于检测样品，电泳是否成功。染胶检测后的凝胶不能进行后续转膜等操作。

7.转膜

湿式电转膜

（1）电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。按三明治模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸)，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透硝酸纤维素NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC膜与胶，NC膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。

（2）转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（-20℃），确保NC膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。

（3）转膜选择恒流，每个转印槽建议电流为150-300mA，时间依据胶的浓度适当调整。转膜结束后，将NC膜置于印迹膜丽春红染色液中，室温5-10分钟即可见红色条带，用洗涤缓冲液洗数次可洗掉红色条带进行后续实验

8.封闭

（1）漂洗印迹膜：使用Western洗涤缓冲液室温漂洗10分钟x3次。

（2）取漂洗过的印迹膜，放入封闭缓冲液中，摇床摇动，4℃封闭1.5-2小时。

9.抗体的杂交

主要采用间接法，即先加入未标记的特异性一抗，抗体与膜上的抗原蛋白结合，再加入酶标(过氧化物酶和碱性磷酸酶)二抗抗体进行杂交检测。

1.向封闭后的印迹膜加入Western专用一抗二抗稀释液稀释后的一抗，40C孵育过夜。

2.洗涤缓冲液洗膜10分钟x3次。

3.加入Western专用一抗二抗稀释液稀释后二抗，4度孵育2h，洗膜3-6次，每次10分钟。

10.检测

根据标记二抗的标记物的不同，其杂交的结果检测方法也不同，常用的检测系统有化学发光检测和化学显色检测系统。

化学发光检测：

将结果记录下来。

（1）ECL显色试剂配制:按1 ml水加入超敏化学发光底物(浓缩型)A.B各50uI混匀；超敏ECL化学发光即用型底物A，B等体积混匀。

（2）以混合好的显色底物覆盖印迹膜1-5min。

（3）在暗室可用放射自显影胶片或化学发光成像系统记录结果

（4）如采用放射自显影胶片，曝光几秒到数分钟，以显影效果确定所测抗原的正确曝光时间。曝光完的胶片先在显影液中冲洗至出现条带为止，再放入定影液中漂洗。

（5）如胶片背景较高或有阴影杂点，用X光片背景去除液试剂去除胶片的高背景和阴影杂点，可得到理想效果的胶片。

（6）NC膜上蛋白如需重复使用，推荐用Western Blot蛋白印迹膜再生液去除膜上一抗二抗，重新进行抗体杂交。

化学显色DAB检测:

（1）DAB显色液的配制:按照1 ml水加显色剂A.B.C各一滴混匀

（2）显色:将适量的DAB显色液平铺在杂交后的印迹膜上，室温放置观察，可出现明显的棕黄色蛋白条带。

二、荧光定量PCR检测ATG、mTOR、caspase-3、Beclin-1

1.蚂蟥消化道组织总RNA提取

（1）将蚂蟥组织放入研钵中，待完全冷冻后，迅速研磨成粉末，始终保持研钵内有液氮。将粉末移入1.5 mL 装有1mL TRIzol的EP管（提前加好trizol）中，剧烈震荡15 s，并在室温放置3 min（配平）。4℃，12000r，10min离心；

（2）称取0.25g凝胶粉末溶解于25ml TAE（1）液体中，制胶，冷却40min以上，后将胶移至电泳液中；

（3）第1步离心结束后，取上清液（600ul）200ul3次至另一离心管（勿吸到底部），加入0.2 mL氯仿，颠倒混匀10次，室温放置2~3 min（配平），4℃，12000离心10 min。样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（上清液最多有400l，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，记录抽取的量，一般为200ul，防止抽到中、下层，）;

（4）在上述第3步的EP管中加入等体积（200ul）预冷的异丙醇，轻轻混匀（配平）， 4℃，12000r，离心10 min, 离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。弃上清。用1ml75%乙醇(DEPC水配置)洗涤RNA胶样沉淀（将底部RNA胶样沉淀轻轻弹起，摇晃洗涤）。4℃，7500r，离心5 min，弃上清，室温干燥一会（或用200ul枪头吸尽75%乙醇），视RNA量加入20~50uL的DEPC水溶解。

（5）点2uL Loading buffer N个(N=取得样品数 1)置于一次性塑料手套上，取4uL Marker和N个样品RNA液与buffer混匀，点样，记好顺序！

（6）140V，15min跑胶。

（7）视跑胶结果，及时将提取效果较好的RNA反转录（一般一个样品提两份RNA），每个样品至少反转录2管（最后每管约20ulcDNA），放入-20℃冰箱冷冻保存。

（8）吸取10ulcDNA原液至新的200ul管中，在加入90ul的灭菌水摇匀稀释，备用。

2.RNA反转录

试剂盒：SYBRGreen Assay（①~⑨管）

（1）反转录3、FZL3，反应体系液10 mL，PCR扩增仪选择加热体积时选择15 mL。

目的：除去基因组的DNA。

顺时针打开预热的PCR扩增仪，将反转录试管放入，检查各管盖子是否扣好，关闭盖子，逆时针拧紧旋钮。调节PCR扩增仪面板：Proceed按键为选择，选择RUN→FZL3→→Block B（灯闪亮）→→No→

（2）反转录4、FZL4，反应体系液25 mL，PCR扩增仪选择加热体积时选择25 mL。

目的：反转录反应。反应液配制应在冰上，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应按反应数＋1的量配制Master Mix，然后分别加取。

顺时针打开预热的PCR扩增仪，将反转录试管放入，检查各管盖子是否扣好，关闭盖子，逆时针拧紧旋钮。调节PCR扩增仪面板：Proceed按键为选择，选择RUN→FZL4→→Block B（灯闪亮）→→No→

反应完成后，保存于洁净试管盒中，记清日期和标号，置于-20℃中长期保存（可保存半年）。

3.扩增内参和ATG、mTOR、caspase-3、Beclin-1比较基因表达差异

（1）按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。

引物可等体积预混，

例：4个处理A,B,C,D,

每个处理跑3个基因1，2，3和一个内参4

（2）引物预混：

以1号引物为例，前序1-f, 后序1-r 各应取4.8ul （0.4*12）

此时若是取各4.8ul的1-f和1-r的引物预混，则不够用，应该各取6ul配置成共12ul的预混液（一定要预留一部分备用），然后1号引物对应的管中加入0.8ul的引物预混液，2，3，4同此方法预混。

然后向黄色区域的加入2ul的底物。

（3）ROX , SYBR Premix Ex Taq和dH2O预混：

装该预混液的离心管需用锡箔纸包住避光，配置该预混液时应避光

以上图为例(48孔，应预留几份备用，一般55倍)

取ROX 0.4*55=22 ul

SYBR Premix Ex Taq 10*55=550 ul

dH2O 6.8*55=374 ul

然后每个管中加入17.2ul的上述预混液，盖上盖离心。

（4）离心完后放入PCR仪中，关好。点start run 。结束后点Export Data输出结果

可行性分析：

① 本项目具有明确的目的，实验设计合理，具有可操作性。

② 在技术力量上，指导老师史红专副教授有多年的蚂蟥研究经验，可以为我们提供指导。

③ 南京农业大学中药研究所具备完善的实验设备，并且有你史红专老师和王嘉师兄的实验经验为指导。

④ 本人已经完成了《无机化学》、《有机化学》《药用植物学》《生物化学》《中药化学》《中药鉴定学》《中药栽培学》等基础课程，具备了完成实验的基础。

4. 参考文献

特色或创新之处：

自90年代发现哺乳动物的细胞凋亡基因以来，细胞凋亡的研究引起了广大生物医学工作者的兴趣，近几年的研究在凋亡信号转导途径、凋亡的生化反应机制以及凋亡的基因调控等方面都取得了显著的进展，在小鼠，兔，果蝇上了的研究也取得了重大成功。细胞凋亡己成为当今生物学研究最新热点之一。然而，在蚂蟥上的研究还未见报道，本实验通过对蚂蟥冬眠期间细胞凋亡和细胞自噬相关的基因表达的研究来探索其调控机制，弥补了蚂蟥细胞自噬和凋亡机制的研究空白，为更进一步的研究和应用提供理论依据和科学指导。

5. 计划与进度安排

研究计划：

2022.10.01-2022.11.30文献整理

2022.12.01-2022.12.14确定实验方案和实验方法