菊叶酚酸类化合物的工艺及保肝作用开题报告

1. 研究目的与意义

内容：本实验主要分析菊叶中酚酸类绿原酸的工艺，以及对酚酸类中绿原酸的保肝作用进行实验研究。

意义：菊花传统入药部位为干燥头状花序，但在采摘菊花的同时，会产生大量的茎、叶，并且产量比菊花大的多。其叶中含有大量的酚酸类化合物。因此对菊叶中酚酸类的化学成分进行系统分析，结合其药理药效，研究菊叶的药用价值，可为菊叶的有效利用提供依据。

2. 文献综述

菊叶酚酸类化合物的工艺及保肝作用

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摘要：菊花是一种药食同源的常用中药，其化学成分复杂，含有黄酮、三萜类和酚酸类等化合物。其有效成分具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、保肝等多种药理作用。其中，具有保肝作用的有效成分主要是黄酮类和酚酸类化合物。对于菊花黄酮类的保肝作用的报道较多，本文将从酚酸类的保肝作用进行概述。

关键词：菊花；酚酸类；绿原酸；保肝；代谢

菊花为菊科菊属植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，既是名贵的观赏植物，又是常用的中药材[1]。中医理论认为菊花性甘、味苦，微寒；归肺、肝经；可散风，平肝明目，清热解毒。临床上菊花主要用于治疗风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花及疮痈肿毒[2]。中国的药用菊花种类繁多，在药材市场上的八大主流商品为杭菊、毫菊、贡菊、滁菊、祁菊、怀菊、济菊和黄菊[3]。我国菊花的药用类群通过人工长期栽培选育已形成一些相对稳定的栽培变种，由于受产地、气候和生态环境等相关因素的影响，不同菊花药材品种所含主要成分差异较大。《中华人民共和国药典》2015年版采用绿原酸的含量作为评价菊花药材、提取物及制剂质量的主要标准之一（其中药典规定含绿原酸(C16H18O9)不得少于0.20％，含木犀草苷(C21H20O11)不得少于0.080％，含3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸(C25H24O12)不得少于0.70％。），绿原酸是菊叶酚酸类保肝作用的主要成分。

1.绿原酸简介

1.1绿原酸的理化性质绿原酸（Chlorogenicacid），分子式C16H18O9,分子量为354.30，熔点为208℃[4-5]。系统名：1,3,4,5-四羟基环己烷羧酸-（3,4-二羟基肉桂酸），化学名：3-O-咖啡酸奎宁酸（3-O-Caffeoylquinicacid),亦称咖啡鞣酸，属于酚类化合物，是由一分子的咖啡酸（Caffeicacd）与一分子的奎宁酸（Quinicacid，1-羟基六氢没食子酸）生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。半水合物为微黄色或白色针状结晶，常温下，其在水中溶解度大约4%,随着温度的升高，溶解度会逐渐升高，微溶于乙酸乙酯，易溶于丙酮、乙醇、甲醇等极性溶剂[6]。

1.2酚酸类的化学结构

由于绿原酸分子结构中含有三个不稳定部分：不饱和双键、酯键及多元酚，所以从植物中提取时，绿原酸可能会通过水解或分子内酯键迁移而产生同分异构体。根据咖啡酰在奎宁酸上的结合部位和数目不同，从理论上讲，单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸所组成的绿原酸异构体共有10种，分别为：1-咖啡酰奎宁酸、3-咖啡酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸、5-咖啡酰奎宁酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、1，4-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸。但到目前为止，从植物中发现的绿原酸异构体有如下：绿原酸（3-咖啡酰奎宁酸）、隐绿原酸（4-咖啡酰奎宁酸）、新绿原酸（5-咖啡酰奎宁酸）、异绿原酸A（3，5-二咖啡酰奎宁酸）、异绿原酸B（3，4-二咖啡酰奎宁酸）、异绿原酸C（4，5-二咖啡酰奎宁酸）、洋蓟素（1，3-二咖啡酰奎宁酸）。已发现的绿原酸异构体的化学结构如下：

绿原酸新绿原酸

隐绿原酸异绿原酸A

异绿原酸B异绿原酸C

洋蓟素

1.3绿原酸的提取方法

菊叶中的绿原酸一般采用传统溶剂（如水提法、醇提法）、微波法、纤维素酶法、超临界CO2等提取方法。溶剂法提取需要消耗大量的有机溶剂，污染环境，且产率较低；微波辅助提取法虽然速度快于溶剂提取法，但是产率仍然较低。超临界CO2提取法虽然产品的纯度高，但在提取过程中需要大量夹带剂，且设备昂贵，产业化生产有一定困难[7]。随着科技的进步，对于菊叶中绿原酸的有效提取，贲永光等人研究出了基于离子液体超声辅助的提取法。该法在单因素实验的基础上，选择提取温度30℃、提取时间30min、超声波功率320W、固液比30:1(mg/L)进行4因素3水平的正交试验，提取菊花绿原酸的产率为2.92%。由表1可见离子液体超声辅助提取法相对水浴法、超声法相比，不仅提取效率高，大大缩短了提取时间，而且节约能耗，降低成本[8]。

表1：不同提取方法的比较结果

1.4绿原酸的纯化方法

大孔吸附树脂由于在中药有效成分的提取分离中，具有独特的优势而被广泛应用于中药材中绿原酸的提取纯化[9]。孟丽[10]等人针对大孔吸附树脂纯化菊花中绿原酸的最佳工艺进行研究和优化。其以绿原酸的吸附率和解吸附率为指标，L9（34）正交设计法筛选绿原酸纯化条件，探索出AB-8大孔吸附树脂对菊花中绿原酸分离纯化的综合性能较好。最佳纯化工艺为上样液绿原酸的质量浓度为1.8mg/ml,上样速度为3BV/h,柱径高比为1：8；最佳洗脱方式为：用2.5倍柱体积的水洗涤除杂，40%乙醇3BV洗脱。结果平均总绿原酸得率为0.81%，含量52.43%。该种纯化绿原酸工艺稳定可行，可用于大规模制备[10]。

1.5绿原酸的检测方法

目前测定绿原酸含量的方法很多，常采用紫外分光光度法、毛细管电泳法、HPLC法。

高效液相色谱法具有高效、快速、精确度高等优点。孙波[11]、刘喆[12]采用高效液相色谱法对提取液中绿原酸的含量进行了测定。结果表明该法具有操作简单、分离效果好、测定迅速等优点。可以用来定量检测绿原酸含量。

紫外分光光度法能满足常规的实验测定。但是容易受到杂志的干扰，会造成测定结果偏大。孙莲[13]等人分别比较了紫外可见分光光度法和HPLC法对绿原酸进行定量检测的结果分析。表明这两种方法测定的结果基本一致，但紫外分光光度法测定值偏高。

高效毛细管电泳法（HPCE)是一种以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法，适合于多种样品的分析。赵陆华[14]等人采用未涂层毛细管柱，测定乌骨藤药材及其制剂中绿原酸的含量。结果表明，该法具有操作简便、准确度高、重现性好等优点，但高效毛细管电泳法设备成本较高，目前尚难以推广。

1.6绿原酸的药理作用

绿原酸作为菊叶重要的成分之一，其药理作用主要表现为：提高机体免疫力、降血压、降血脂、抗肿瘤、抗癌、抗氧化、抗病毒、延缓衰老、抗菌消炎、利尿、保肝利胆等。现代研究证明，绿原酸对因化疗、放疗所致的白细胞减少症及人体各种急性细菌感染疾病有显著疗效，曾经在SARS病毒流行治疗中起到了不可忽视的作用，它也是目前世界上关注度极高的单体植物药之一，被称为植物白细胞[15]。此外，绿原酸还可作为良好的抗氧化剂，保护胶原蛋白不被活性氧等自由基损害，可取代传统食品中的人工合成抗氧化剂。目前，绿原酸已用于食品、医药、日用化工等领域[16]。

2.绿原酸的保肝作用

2.1绿原酸的抗肝纤维化作用

绿原酸对四氯化碳导致的肝纤维化大鼠的保肝作用，表现为明显对抗四氯化碳所致的肝纤维化大鼠肝脾系数的升高，显著对抗血清中丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶（AST）活性的升高，降低血清中透明质酸（HA），层黏连蛋白（LN），肝纤维化4项指标III型前胶原（PCIII），IV型胶原（CIV），球蛋白（GLOB）的含量，升高血清中的天冬氨酸总蛋白（TP），白蛋白（ALB）含量和白蛋白与球蛋白的比值（A/G），降低组织中丙二醛（MDA）和尿羟脯氨酸（Hyp）的含量，升高肝组织中SOD（超氧化物歧化酶）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。绿原酸各剂量组中绿原酸高剂量组抗纤维化的效果最好，并呈现明显的剂量依赖性。病理结果亦显示绿原酸具有良好的抗纤维化的作用[17]。

2.2绿原酸的化学性肝损伤的保护作用

绿原酸对四氯化碳所致肝损伤也具有保护作用，绿原酸14、7、3.5mg/kg剂量组小鼠的肝指数、脾指数，小鼠血清中ALT、AST活性，小鼠肝组织中MDA的水平，均明显低于模型组，绿原酸14、7、3.5mg/kg剂量组，小鼠肝组织中SOD活性、GSH-Px活性，均明显高于模型组，同时，绿原酸各剂量组肝组织病变程度明显减轻，肝细胞再生明显，偶伴有点状坏死，汇管区少量炎细胞浸润，证明绿原酸具有明显的抗肝损伤的作用，其作用可能与其能清楚体内自由基和抗氧化的作用有关[18]。

体外实验表明绿原酸对氧自由基有抑制作用，存在剂量效应关系，能显著提高仔猪血浆中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性以及抑制羟自由基能力[19]。胡宗福等人采用化学发光法研究发现，绿原酸对O2.、.OH和H2O23种活性氧均有清除作用，其清除能力与浓度呈剂量关系。对O2.和.OH清除效果不理想，甚至产生一定的促氧作用[20]。在化学模拟条件下绿原酸及其包合物都能够有效清除O2.和.OH及在高温条件下可抑制猪油过氧化值（POV)以及酸价（AV)值的增加，并且超过阳性对照物茶多酚的作用[21]。对于上文提及的绿原酸对四氯化碳所致肝损伤具有保护的作用，绿原酸对氯自由基的抑制作用可能与对氧自由基的抑制作用有相似之处，关于这点的证实有待研究。

2.3抑制高脂型脂肪肝形成

近年来研究表明绿原酸能抑制前脂肪酶细胞的增加这可能对减少肥胖有影响。Ae-SimCho[22-23]研究了绿原酸对调整高脂膳食中脂肪代谢的影响，本研究通过将绿原酸和咖啡酸同时添加到高脂膳食中，研究绿原酸和咖啡酸对降低体重、血浆、肝和肾脏中甘油三酯胆固醇的量，及其对脂肪代谢酶及其肝脏中过氧化物酶受体表达的影响。结果表明：绿原酸和咖啡酸能显著改善体重重量，调节脂质代谢抑制葡萄糖-6-磷酸酶活性，通过减少氧化低密度脂蛋白的量达到减少心血管疾病的发生和总胆固醇的量。

3.绿原酸在肠道微生物作用下的代谢机制及代谢动力学

研究表明，酚酸类物质在机体的健康作用比黄酮类物质大,然而目前多酚类的研究主要集中在对黄酮类物质在机体内的代谢机制及生物利用度，对酚酸在机体内代谢机制的研究相对较少，骆成尧等人通过体外模型进一步研究绿原酸在盲肠微生物菌群及酶作用下的代谢机制及代谢动力学。结果显示，绿原酸在盲肠食糜中代谢机制主要发生水解反应生成咖啡酸和奎宁酸，然后再进一步代谢生成其他酚酸类化合物被机体吸收利用以发挥其生物活性，其Ⅱ相代谢如硫酸化、葡萄糖醛酸化及甲基化代谢，主要不是在盲肠微生物及酶的作用下代谢，即绿原酸在盲肠食糜中以相代谢为主，Ⅱ相代谢次之。同时，对其代谢产物的代谢动力学也有相对清晰的了解，绿原酸一部分以原形物的形式被胃和小肠吸收，另外一部分则直接到达大肠被肠道微生物水解代谢，在肠道水解酶作用下释放出游离咖啡酸。由计算可知，大约有摩尔浓度为67.47%的绿原酸在大肠中发生代谢，而游离咖啡酸摩尔浓度大约为绿原酸的53.84%，绿原酸水解是相代谢的起始，其中大约53.84%的咖啡酸在食糜发酵中被检测到，因此可以间接推论出，在机体内绿原酸主要以相代谢为主，说明盲肠食糜中大量存在水解绿原酸的酯酶[24]。

4.结语

对于菊叶中酚酸类的主要成分绿原酸以及其肠道微生物作用下的代谢机制及代谢动力学，我们已经有相对详细的了解，这对其在保肝作用方面有进一步的研究提供了不可或缺的理论知识。目前,绿原酸在保肝方面的作用主要是抗纤维化、抗肝损伤和抑制脂肪肝的形成，随着人类疾病不断的变异性，我们应该探索更多有关其保肝方面的知识。

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3. 设计方案和技术路线

研究方案：

一、药材提取：药材菊叶以两倍于生药体积的80%乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并提取液，减压去除乙醇，得到总浸膏。将总浸膏悬于水中，以石油醚萃取，去除叶绿素等脂溶性成分。水溶液减压浓缩。

4. 工作计划

2016.01～2016.02：进行文献检索，确定实验方案。进行试验器材、试剂准备和预实验。

2016.02～2016.04：正式实验，进行菊叶的化学成分和药理作用研究

2016.04～2016.05：数据分析，论文整理

5. 难点与创新点

药用菊花传统以其干燥头状花序入药，菊叶为其非药用部位，故叶片等地上部分一般都被废弃处理，造成资源浪费。研究菊叶化学成分及药理作用的文献较少。因此本课题研究菊叶的化学成分及药用价值，可以为扩大菊的药用部位、加强菊花非药用部位的资源利用提供科学依据。