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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1植物乳杆菌发酵果蔬可提高果蔬的品质与价值
我国是世界上最大的果蔬生产国[1]。果蔬富含维生素、抗氧化因子、矿物质、膳食纤维和多酚等物质，但新鲜的果蔬原料存在货架期短、不便于储存等问题[2]。为弥补果蔬原料性质的缺陷，对其进行适当的加工是必要的，其中，果蔬汁保留了果蔬原有的风味、营养，占有较大的市场比例[1]。果蔬发酵是在果蔬汁体系中接种食用微生物，经过微生物的作用制得产品的加工技术，它不仅是一种延长果蔬产业链的重要技术，也是提高果蔬汁营养功能的重要手段。发酵可以给果蔬汁带来如下特点：（1）提高安全性，因为该过程是自然的，限制有害的生物污染物。（2）提供新香气，质地或味道等感官改性。（3）延长食品的保质期。（4）剩余未使用的原始植物材料的增值[3]。因此果蔬发酵具有重要的研究意义。其中苹果种类繁多，营养丰富，是消费者日常购买最多的一种水果，也是人们饮食中外源性抗氧化物质的重要来源[15-16]。苹果汁具有独特的风味，含有糖类、维生素、多酚等多种营养物质，非常受人们的欢迎。目前，我国苹果汁生产快速发展，在产业规模、生产成本、出口贸易等方面表现出较强的优势[17]。
植物乳杆菌是乳酸菌中重要的一种,能在胃肠道壁上定植,发挥调整胃肠道中微生物菌群的作用,同时它也广泛的应用于食品生产[4]。在食品中植物乳杆菌可以用于发酵蔬菜类食品如泡菜、橄榄菜等[3]。此外他还应用在奶酪、酸奶香肠、葡萄酒等中。在保健品中植物乳杆菌还可以用于微生态试剂的生产[5]。emmanuel kwawa等人研究了植物乳杆菌在桑葚中发酵引起的抗氧化活性的变化，发现发酵后抗氧化活性增加[6]。ratchadaporn kaprasob等人发现腰果苹果汁中该研究表明，经过植物乳杆菌发酵，生物活性部分如维生素c和酚类化合物及相关抗氧化剂可以有利地调节到更高水平[7]。因此选择植物乳杆菌作为研究的对象有丰富的理论基础。
2. 研究的基本内容和问题
| 研究的目标、内容和拟解决的关键问题 2.1 研究目标 2.1.1阐明低场强功率超声波处理对植物乳杆菌代谢多酚的影响，找出多酚代谢与氨基酸代谢糖代谢之间的联系，从而尝试找出低场强功率超声波促进植物乳杆菌代谢多酚的生化机理。 2.2 拟解决的关键科学问题 探明在植物乳杆菌发酵过程中，低场强功率超声波对多酚代谢的影响，并研究在此超声条件下植物乳杆菌糖氨基酸的代谢变化。在此基础上，寻找多酚代谢与氨基酸代谢糖代谢之间的关系，从而为调控该过程提供理论基础。 2.3 研究内容 2.3.1 低场强功率超声波促进植物乳杆菌生物转化多酚过程中菌体的生理特性研究 选取多酚含量丰富的苹果榨汁，接种植物乳杆菌发酵。采用脉冲低场强功率超声波处理菌液，然后监测菌体生长情况，分析菌落数的变化。 2.3.2 低强度功率超声场下植物乳杆菌生物转化多酚的研究 在低场强功率超声波辅助植物乳杆菌发酵的不同阶段，收集发酵样液，采用超高液相色谱并联质谱鉴定发酵液中多酚及其衍生物，在此基础上阐明超声对其的影响。 2.3.3 低强度功率超声场下植物乳杆菌糖、有机酸、氨基酸代谢的研究 在低场强功率超声波辅助植物乳杆菌发酵的不同阶段，收集发酵样液，采用超高液相色谱并联质谱鉴定发酵液中氨基酸糖、有机酸，在此基础上阐明超声对其的影响。
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3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 3.1 研究方案 3.1.1 低强度超声场辅助植物乳杆菌代谢多酚的发酵条件的建立 选取本实验室保藏的植物乳杆菌BNCC191046，接种于MRS培养液（不含酚酸）中，37℃静置培养24h，制备成种子液。将种子液分别接种于灭完菌的苹果汁中，确保菌体初始浓度达到7.0 log CFU/mL。然后使用20kHz的探头式超声波作用于接种后的培养液，超声强度范围为20%、30%、40%，超声时间为2min、15min、30min，模式为5s on, 5s off，超声一次，超声作用时间点为延滞期、对数期、稳定期。超声处理完之后将样液密闭置于30℃培养箱静置培养，超声后0h、2h、4h、6h、12h、24h为取样点，并于每次超声处理前取样待分析。 实验所用的苹果汁由苹果削皮去核榨汁，添加10%的去离子水，0.15%（苹果重量计）的抗坏血酸钠护色。3000r/min离心15min,取上清液，调整可溶性糖为13度，用碳酸钠调整pH=6.0,85℃水浴灭菌20min。 以多酚代谢变化程度作为衡量标准，选取最佳的超声条件进行后续实验。 3.1.3最佳低强度超声场辅助植物乳杆菌代谢多酚的发酵苹果汁多酚物质的分析 将不同时间段收集的发酵液离心收集上清液。 采用HPLC/Triple-TOF-MS鉴定蓝莓汁和甘蓝汁中酚酸的种类以及发酵上清液中酚酸衍生物的种类，将检测到的质谱信号与数据库信息和标准物质进行比对，确定酚酸及其衍生物的类别。然后在HPLC上建立各种酚酸类物质及其衍生物的标准曲线。液相柱为Agilent Zorbax Eclipse SB-C18，流动相为含1%三氟乙酸的水溶液和含1%乙酸的甲醇，检测波长为280nm。发酵上清液进HPLC分析前，调节溶液pH至2.0，然后加入NaCl使溶液饱和，再用乙酸乙酯进行萃取，收集有机相运用旋转蒸发将其浓缩，然后复溶于甲醇中，过膜进HPLC分析。 采用DPPH和ABTS法测定发酵上清液清除自由基的能力，以Trolox为对照。采用FRAP法测定样品的Fe3 还原能力，以FeSO4为对照。 3.1.4低强度超声场辅助植物乳杆菌其他代谢组分的分析 不同时间段收集的发酵液经离心后得到上清液。采用HPLC法测定发酵上清液中苹果酸、乳酸、乙酸含量。色谱柱为Aminex HPX-87H，流动相为6 mM的H2SO4溶液，柱温为45℃，检测波长为210 nm和290 nm。建立各种纯物质的标准曲线，用于上述有机酸含量的测定。 采用氨基酸分析仪检测发酵上清液中各种氨基酸含量的变化。进样前加6 mol/L的H2SO4溶液和苯酚，于110℃水解24 h。适当稀释后采用氨基酸分析仪检测各种游离氨基酸的含量。 3.2 技术路线
3.3 关键技术 发酵技术：采用低场强功率超声波辅助植物乳杆菌发酵。 发酵液组分分析：HPLC/Triple-TOF-MS鉴定酚酸及其衍生物种类；采用HPLC测定酚酸及其衍生物、苹果酸、乳酸、乙酸、葡萄糖的含量；采用HS-SPME-GC-MS测定乙醇的含量；采用氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸的种类和含量；采用ABTS、DPPH和FRAP发测定体外抗氧化活性。 |
4. 研究创新点
4.1 乳酸菌发酵果蔬汁可以改善果蔬汁原本的风味与营养，在一系列的转变中，多酚物质的氧化和还原是一个主要原因，微生物对其的代谢作用已经有文章报道，但是低强度超声辅助植物乳杆菌发酵果蔬汁代谢多酚还没有被研究和报道。本项目首次把超声波的影响迁移到多酚上来，推动功能性果蔬制品的绿色加工技术的开发。
4.2 本项目从超声对菌体生化形态、糖氨基酸代谢、多酚的代谢变化进行了全面的研究。并运用数据挖掘的方法寻找出多酚代谢与氨基酸代谢糖代谢之间的关系，为定向调控该代谢途径提供理论基础。
5. 研究计划与进展
| 研究计划及预期进展 5.1 2018年11月至2018年12月 建立对植物乳杆菌发酵苹果汁代谢有显著影响的超声条件范围。 研究低强度超声场下细胞数的变化
5.2 2019年1月至2019年3月 鉴定功率超声波辅助植物乳杆菌代谢多酚过程中多酚及其衍生物的种类，并检测其含量。 分析超声波辅助植物乳杆菌代谢过程中发酵液有机酸、葡萄糖和氨基酸的变化。 5.3 2019年4月至2019年5月 分析糖氨基酸多酚的数据，进行数据挖掘寻得他们之间的变化关系。
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