1. 研究目的与意义
果蔬来源外泌体样囊泡中（elvs）含有特定的脂质、蛋白、核酸等成分，与动物来源的外泌体类似，每种成分都可能通过某种特殊的机制发挥相应的生物学功能，从而对疾病的发生、发展起到一定的作用。动物来源的外泌体在细胞间通讯中扮演着重要角色，具有调控基因表达和调节细胞代谢的功能，在炎症发生和免疫调节等多个生理过程中发挥着重要的作用[1][2]。
目前外泌体的提取方法有超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、聚乙二醇（peg）沉淀法、试剂盒提取法（exo-quick法，qev技术）、sec法、超滤离心法、免疫磁珠法等，我们可以根据其原理将这些方法分成五大类。基于密度的分离方法：超速离心法，蔗糖密度梯度离心法；基于大小的分离方法：sec法[3,4]，超滤法[5]；基于表面成分亲和力的分离法（免疫磁珠法）：蛋白质[6]，膜磷脂[7,8]；沉淀法：聚乙二醇（peg）沉淀法[9]，试剂盒法[10]；微流控芯片法[11,12]。
葡萄、西兰花和生姜来源的elvs在维持肠道稳态、预防结肠炎发生中具有潜在的干预作用，可以在一定程度上预防由葡聚糖硫酸钠（dss）引发的小鼠结肠炎。肠干细胞在维持肠道组织的稳定性中具有重要作用，葡萄来源的 elvs 可以穿过肠道粘液进而被小鼠肠干细胞吸收，并通过wnt/β-catenin途径诱导 lgr5hi 肠道干细胞增殖，从而加速肠粘膜上皮的恢复，避免由 dss 引起的结肠炎[13]。西兰花来源的 elvs 可以靶向树突状细胞（dc），激活 dc 中腺苷单磷酸激活的蛋白激酶（ampk），从而减少细胞因子 ifn-γ、tnf-α 的释放，并提高抗炎因子的表达，防止肠道 dc 的激活，进而诱导形成耐受性 dc[14]，使 dss 引发的小鼠结肠炎症状得到改善。生姜来源的 elvs 可以通过其中的 mirnas调节小鼠肠道中乳杆菌的基因表达，在促进乳杆菌繁殖的同时，产生更多具有保护肠道的芳烃受体的配体，如吲哚-3-甲醛等，进而诱导肠组织产生更多的 il-22，有助于维持肠道稳态，改善结肠炎[15][16]。此外，生姜来源的 elvs 在预防和治疗慢性牙周炎[17]以及保护酒精引起的肝损伤方面也具有潜在的干预作用[18]。
2. 研究内容和预期目标
研究内容：
1）采用常用外泌体提取方法提取生姜和大蒜来源外泌体；
2）通过物理化学生物学方法对外泌体的组分和结构进行表征；
3. 国内外研究现状
果蔬中的外泌体样囊泡（exosome-like Vesicles，ELVs）是由果蔬细胞释放的纳米级囊泡结构，与动物的外泌体拥有类似的超微结构，但其脂质、蛋白质及核酸等化学成分具有显著差异，并具有独特的生物学功能。2013 年，诺贝尔生理学或医学奖授予了 James E. Rothman、Randy W. Schekman 和 Thomas C. Sdhof 三位科学家，以表彰他们在细胞囊泡运输的调控机制方面做出的突出贡献。外泌体作为细胞囊泡的重要一员，相关研究亦受到广泛关注，并相继从人、鼠、牛等动物的组织或细胞中分离鉴定出了外泌体[21][22]。2013 年，Song 等人[23]通过差速离心和蔗糖梯度离心相结合的方法首次从葡萄中分离、纯化出了大量 50 nm~300 nm 的囊泡状结构，并将这种由植物细胞分泌至胞外的类似于动物外泌体的囊泡称为外泌体样囊泡（exosome-like Vesicles，ELVs），其与外泌体结构相似，且均含有蛋白质、脂质和 RNA 成分。果蔬来源的 ELVs 已被尝试用作药物的递送系统，如利用从葡萄柚中制备的ELVs 作为载体包封 MTX 后，可以将 MTX 靶向递送至肠道细胞，并通过减少细胞因子 TNF-α、IL-1β和 IL-6 的产生而缓解由 DSS 诱导的结肠炎[24]；利用从生姜中分离的 ELVs 为载体，采用超声的方法装载 DOX，其装载效率可高达 95.9%0.28%，通过叶酸配体进行靶向修饰后，可以高效靶向并显著抑制异种移植的 Colon-26 肿瘤细胞的生长[25]。除用于装载小分子药物外，果蔬来源的 ELVs 还被尝试用于装载 miRNA，如利用从番茄中制备的 ELVs，采用电穿孔法包裹模型药物 DiI 和 FAM 标记的反义 EBV-miR-BART7-3p，结果发现两者均可以高效进入细胞的胞浆，且以 ELVs 为载体的基因沉默效果优于阳离子脂质体[26]。
之后，科学家相继对生姜、葡萄柚、梨、柠檬等数十种果蔬中的 ELVs 进行了分离、纯化和鉴定，对其结构和化学组成进行了表征，并对其生理功能进行了评价，发现果蔬来源的ELVs 具有维持肠道稳态等多种独特的生理活性，并具有递送药物的潜在载体功能，显示出了广阔的应用前景。
4. 计划与进度安排
2022.9-2022.10 确定论文题目，查阅相关文献资料，确定实验方法
2022.11-2022.12 进行生姜和大蒜来源外泌体的提取实验和表征实验，撰写开题报告
2022.1-2022.2 生姜和大蒜来源外泌体对结肠细胞生长活力的影响
5. 参考文献
[1] console l, scalise m, indiveri c. exosomes in inflammation and role as biomarkers[j]. clinica chimica acta international journal of clinical chemistry, 2019, 488: 165-171.
[2] tkach m, thery c. communication by extracellular vesicles: where we are and where we need to go[j]. cell, 2016, 164(6): 1226-1232.
[3]bing an,vander pole,grootemaatae,et al.single-step isolation of extracellular vesicles by sizeexclusion chromatography[j].j extracell vesicles,2014,3(1): 23430-23436.
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