大豆源gma-miR159a的抗肿瘤活性及稳定性研究开题报告

1. 研究目的与意义

miRNAs是一类19-21nt的非编码小RNA，它通过与目标mRNAs分子的3''端非编码区域的碱基进行互补配对,引起靶miRNAs的降解或抑制其翻译，来实现对基因进行转录后的表达调控。研究发现，植物miRNAs可以被哺乳动物吸收并发挥跨物种的基因调控，在诸多疾病中起到重要作用。大豆gma-miR159a已被证明可以被人体吸收并具有一定的抗肿瘤活性，但是由于miRNAs的不稳定性可能会严重阻碍miRNAs的吸收，因此评价大豆gma-miR159a在体外的稳定能力，包括加工过程中的水平变化，对于保证其功能的发挥具有重要意义。

2. 研究内容和预期目标

研究内容：

1. 测定得到大豆制品（蒸煮大豆、豆浆、豆腐等）中gma-mir159a的含量。

3. 国内外研究现状

2011年9月，我国南京大学张辰宇教授课题组首次在Cell Research杂志报道了食物来源的外源植物miRNA能够通过小鼠的胃肠道等消化器官进入其血液循环系统进而快速分布到体内的不同组织器官，并能跨物种地调控小鼠自身的基因表达，同时该课题组还在人、大鼠、牛和羊的血清中检测到了外源性植物miRNA的存在。 植物miRNAs的膳食摄入机制尚不清楚，但目前认为植物成熟的miRNAs在饮食后被肠道吸收并被MVs包装，然后通过血液循环进入体内的各个部位。最近的研究表明人体中存在大量的大豆miRNAs。Liu等人收集并检查了410个可获得的公共的小RNA测序数据集，通过与大豆基因组比较，最终检测得到几十种大豆miRNAs家族的存在，常见的如gma-miR5368、156、159以及168等。Chin等人在人血清中同样发现大量大豆miRNAs的存在，其中鉴定得到98种大豆miRNAs，其中gma-miR159、166及156等家族显示出了较高的水平。另外，Anna等人在猪及人的母乳外泌体中同样检测到了大豆miRNAs的存在。另外，在早期的研究中，Zhang等人发现在中国健康人体的血清中存在大约30种已知的植物miRNAs，其中不乏相同序列的大豆保守miRNAs。由此可见，大豆miRNAs早已成为人体内的“常客”，其具有通过胃肠道进入人体或其他哺乳动物体内的能力，这预示着大豆miRNAs可能作为一种新型营养素在人体中发挥着潜在的调控能力，与某些疾病的调控息息相关。 植物miRNAs在Dicer加工之后存在甲基化现象，相对于动物miRNAs来说，3’末端的甲基化可能使得植物miRNAs更加稳定。大豆作为常见的豆科类植物，大豆miRNAs同样具有高稳定性的特性。Anna等人通过模拟人体消化过程确定了大豆miRNAs的生物可利用性。在储存，加工，蒸煮和早期消化过程中通过实时PCR测量了大豆中富含的三种miRNAs（gma-miR166、167及168）的水平。研究发现，在贮藏，加工和蒸煮处理后，大豆中三种miRNAs的水平相当高，在蒸煮后的汤汁中也检测到了较高水平的miRNAs。同时，通过模拟人类消化系统，显示在75分钟的早期阶段消化之后，大豆miRNAs具有显著的稳定性，较新鲜大豆相比，仍具有高水平的表达，揭示了大豆miRNAs的生物可利用性。因此，大豆miRNAs在食品加工及饮食消化过程中具备一定的稳定性，进一步研究大豆miRNAs的生物稳定性将为大豆miRNAs的膳食递送及功能调控提供了研究基础。

4. 计划与进度安排

1. 测定得到大豆制品（蒸煮大豆、豆浆、豆腐等）中gma-mir159a的含量。

（1）将大豆在煮沸条件下蒸煮10min、20min、30min，蒸煮完成后迅速冷却，液氮下研磨后，通过trizol法提取总rna。实验以未经任何处理的大豆作为对照组，利用qrt-pcr检测gma-mir159a的含量。

（2）将大豆按照地方标准制备豆浆，冷却后，通过trizol法提取总rna。实验以未经任何处理的大豆作为对照组，利用qrt-pcr检测gma-mir159a的含量。

5. 参考文献

[1] 母治平.猪体内食物源性植物mirnas的鉴定[d].成都:四川农业大学动物遗传育种研究所,2013.

[2] philip anna，ferro valerie a，tate rothwelle j. determination of the potential bioavailability of plant micrornas using a simulated human digestion process.[j]. molecular nutrition amp; food research,2015,59(10),1962–1972. doi:10.1002/mnfr.201500137

[3] liang, h., zhang, s., fu, z., wang, y., wang, n., liu, y., … zhang, c.-y. (2015). effective detection and quantification of dietetically absorbed plant micrornas in human plasma. the journal of nutritional biochemistry,2015,26(5)，505-512.doi:10.1016/j.jnutbio.2014.12.002