pksC基因敲除对乳酸乳球菌N8合成Nisin 的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：nisin是一种高度翻译后修饰的细菌素，是由属于 n 血清型的某些乳酸链球菌产生的一种多肽物质，能够抑制部分革兰氏阳性菌的生长[1-2]。其已在食品、药品中得到了广泛的应用，所以提高nisin的产量显得尤为重要[3-4]。nisin 的生物合成与调控机制是一个复杂的网络机制，近几年的研究证明，除nisin生物合成基因簇中的11个基因(nisa/zbtciprkfeg)外，仍有很多其它基因参与其中[5]。实验室前期研究表明nisz与非核糖体肽(nrpss)合成相关基因pksc转录水平呈负相关，通过删除pksc基因，实现nrpss合成通路的阻断，从而提高nisin的产量。本实验主要通过同源重组方法对pksc基因实现删除[6-7]，比较突变菌株与原始菌株在生理生化等多个水平（包括生长状况，nisz的转录及nisin效价等）上的差异，进一步阐述nisin生物合成的网络调控机制，旨在从根本上为构建nisin高产基因工程菌提供理论依据，从而进一步达到提高nisin产量的目的。

国内外研究概况：nisin是主要由乳酸乳球菌产生的一种翻译后修饰的羊毛硫细菌素，具有广谱杀菌作用，在食品医疗等多个领域有很好的应用前景。通过理化诱变、插入突变、基因敲除、改变培养条件等方法已经在不同程度上提高了乳酸菌合成nisin的产量。前期国内外研究一直致力于合成及纯化nrpss[8]，但我们发现nisz与pksc基因转录水平呈负相关，这为提高核糖体肽nisin的产量提供了新思路，能否通过阻断与核糖体肽合成有底物竞争关系的nrpss合成通路来提高nisin的产量。本研究以此为出发点，探究pksc基因的敲除对nisin产量的影响。

应用前景：nisin分子的物理、化学性质及其毒理、代谢和生物学功能不仅使它适于用作食品防腐剂，在兽医和药用领域。口腔保健也具有很大的潜力。已被用于口腔漱口液防止龋齿和牙龈炎，或用于治疗牛乳腺炎和人胃溃疡甚至艾滋病等方面[9]。具有广阔的应用前景，所以提高其产量就尤为重要。

2. 研究的基本内容和问题

研究目的：前期有研究表明nisz与pksc基因转录水平呈负相关，通过删除pksc基因，实现非核糖体肽nrpss合成通路的阻断，来提高核糖体肽nisin的产量。进一步阐述nisin生物合成的网络调控机制，旨在从根本上为构建nisin高产基因工程菌提供理论依据，从而进一步达到提高nisin产量的目的。

研究内容：

1、构建适合本实验室乳酸乳球菌n8的基因敲除方法。

3. 研究的方法与方案

技术路线：上下游同源臂融合

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敲除载体构建

4. 研究创新点

1、构建适合本实验室乳酸乳球菌N8的基因敲除方法

2、前期国内外研究一直致力于合成及纯化非核糖体肽NRPSs，而本实验则是通过阻断非核糖体肽的合成通路来提高与其有底物竞争关系的核糖体肽Nisin产量。

5. 研究计划与进展

2014.12 2015.2 敲除载体的构建

2015.02 2015.03 pksc基因的删除，重组子的筛选

2015.03 2015.05 缺失菌株与野生菌株表型及理化差异的分析