蔗糖异构酶在枯草芽孢杆菌芽孢的表面展示开题报告

文献综述

1.1研究背景

异麦芽酮糖是近年来新兴的一种功能性甜味剂，在食品、医药等工业中具有广阔的应用前景。蔗糖异构酶是催化蔗糖异构为异麦芽酮糖吡喃葡糖基-D-果糖和海藻酮糖的关键酶。作为一类具有保健功能的新型甜味剂，异麦芽酮糖和海藻酮糖特别适合替代蔗糖和其它淀粉糖用于生产无糖食品﹑无糖保健品和无糖药品。

蔗糖异构酶是生物转化生产异麦芽酮糖和海藻酮糖最有效的酶，因此通过蔗糖异构酶生物转化蔗糖实现两种糖的产业化生产正成为人们研究的热点。目前国内外异麦芽酮糖的生产普遍采用酶转化法，即通过微生物体内的蔗糖异构酶(sucroseisomerase简称SIase)催化蔗糖而进行。芽孢表面展示技术具有作简单、稳定性好、安全性高的优点，因而被广泛用于口服疫苗、医药和全细胞催化剂等领域。实现芽孢表面展示技术的关键是需要一种高丰富度、表面结合能力强的芽孢衣壳蛋白。枯草芽孢杆菌属(BacillusSp)在营养匮乏、环境恶劣下，其自身的营养细胞会形成一种休眠体，即芽孢。枯草芽孢杆菌是GRAS菌种之一，因而它产生的芽孢是安全无毒的［2］。芽孢衣壳蛋白层一般是由超过50余种的蛋白质构成，分外层和内层。目前，已被成功应用的芽孢衣壳蛋白则都是来源于外层，如CotB、CotC、CotG和CotX［4－7］。CotB和CotC常用于锚定抗原制备疫苗，而CotG则锚定酶蛋白发挥全细胞催化剂功能。通过芽孢表面展示技术将功能活性酶展示在芽孢表面为全细胞催化剂已成当前表面展示技术研究的热点。本研究以β-半乳糖苷酶为目标蛋白，选用CotB、CotC、和CotX四种芽孢衣壳蛋白作为子载体，将β-半乳糖苷酶展示于芽孢表面，并比较了4种分子载体的展示能力，从而筛选出能够适合展示β-半乳糖苷酶的分子载体。

1.2研究目的及意义

异麦芽酮糖和海藻酮糖是一类还原糖，在天然蜂蜜中少量存在，具有与蔗糖类似的物理性质和口感，此外还具有一些蔗糖无以伦比的优良特性，如甜度低，海藻酮糖甜度为蔗糖的70%[2]，而异麦芽酮糖仅为蔗糖的52%[3]，非致龋齿性，被人体食用后在血液中释放单糖的速度缓慢且不刺激胰岛素分泌，因而有益于糖尿病的防治并可防止脂肪的过多积累[4-5]。

生理功能及应用前景(1)适宜给长时间体育运动者提供能量异麦芽酮糖进入人体后，可在小肠处由蔗糖酶一异麦芽糖酶复合催化水解成与蔗糖分解物相同的葡萄糖和果糖，从而被消化、吸收。但由于其分解速度是蔗糖的五分之一，由此可推测异麦芽酮糖的吸收速度要比蔗糖慢得多，此外，异麦芽酮糖能够全部被消化、吸收转化为能量，故特别适宜于给持续长时间的体育运动者提供能量。(2)长时间使血中葡萄糖和胰岛素维持在一定浓度摄人异麦芽酮糖后，能长时间使血中葡萄糖和胰岛素保持在一定浓度，这是由于异麦芽酮糖的消化、吸收速度慢的缘故。在食人快速分解成葡萄糖的糖类时，随着血中葡萄糖的急速上升，使得胰岛素分泌过剩，反而引起低血糖,使运动能力减弱。因此，在食用以这些糖类为甜味剂的食品时，必须充分注意进食时间，而在摄取使用异麦芽酮糖的食物如运动饮料时，就不会出现上述现象，因此，不用调整进食时间。(3)将体内脂肪作为热量利用通常人在运动以后，要补充热量和水分，但在摄取以异麦芽酮糖为甜味剂的饮料时，不会使血中游离脂肪酸(FFA)的浓度下降。在耗时较长的运动中，体内脂肪被加水分解、血中FFA水平增加，FFA就作为热源不断被利用、消耗。但是在运动结束后如果摄人快速分解成葡萄糖的糖类，血中葡萄糖水平就要上升、血中FFA下降，而此后FFA的消耗减少。但如果是使用了异麦芽酮糖，血中葡萄糖水平不上升、FFA不下降。这说明在使用异麦芽酮糖时，运动结束后，也要持续一会继续消耗脂肪酸，使体内脂肪减少。(4)可以大量摄入在比较激烈的运动过程中，作为热量源必须补充30一60g/h的糖类。糖类若使用异麦芽酮糖，一次摄入80g也不会引起腹泻，同时如前所述，也不会引起血糖值和胰岛素浓度的急速上升，另外，异麦芽酮糖的甜味与蔗糖相似，但甜度只是蔗糖的42%。因此，将异麦芽酮糖用于运动饮料，从生理上来说能够大量的摄入，而从感官上来讲，即使高浓度也不会影响口感。(5)保持注意力集中血糖值及胰岛素浓度的急速上升或下降,都会影响体内的机能及精神状态的稳定。而摄入异麦芽酮糖后，血糖值及胰岛素的浓度比较空腹时仅提高10~20%，且能长时间保持这一状态；另外，能够持续供给大脑一定浓度的葡萄糖。由此我们可以推测，摄入异麦芽酮糖能够稳定体内机能和精神状态。

1.3研究现状及分析

研究表明，利用游离细胞转化蔗糖生产异麦芽酮糖分离提取较困不适合于大规模的工产大多研究者倾向于利用固定化细胞来转化蔗糖，最近报道，Haroldo[9]等将Erwiniasp固定化细胞应用在填充床反应器中转化蔗糖生成异麦芽酮糖，蔗糖转化率64.1%Serratiaply-muthica[10]Protaminobacterrubrum[11]等菌株也曾被利用于固定化转化蔗糖生成异麦芽酮糖；但大部分菌株存在细胞酶活低，酶转化时间长，固定化细胞不稳定的问题，因此提高生产菌株中蔗糖异构酶的活力以及酶转化时的细胞利用率显得非常要。

SIase是生物转化蔗糖生产异麦芽酮糖和海藻酮糖最有效的酶，近年来围绕产酶菌株筛选、酶的结构解析以及固定化细胞生产异麦芽酮糖等领域，开展了大量的研究工作，丰富了人们对SIase的认识。然而作为一种有着重要工业应用价值的酶，仍存在以下问题有待解决。(1)现有SIase产生菌的产酶水平较低，酶的生产成本过高，今后应从SIase高产菌株的选育、产酶基因工程菌株的发酵工艺优化方面开展工作，大幅度提高产酶水平，降低其生产成本。(2)在研究SIase结构的基础上，确定影响其性质的关键区域，通过分子改造技术改善其催化性质，如产物特异性、最适反应温度、提高热稳定性等，将对异麦芽酮糖和海藻酮糖的工业化生产具有重要的意义。(3)构建高效的基因工程产酶菌株已成为异麦芽酮糖研究的主流趋势，但是异麦芽酮糖（或海藻酮糖）作为一种功能性食品添加剂，用大肠杆菌作为宿主菌存在着安全隐患，因此构建食品级的基因工程菌将成为异麦芽酮糖研究的热点问题。

参考文献

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2.1研究内容

本研究前期通过基因工程的手段将蔗糖异构酶基因和芽孢的芽孢衣壳载体构建到整合质粒上，并通过枯草的化学转化法将整合质粒转化进入枯草基因组，并筛选到阳性转化子，通过DNS法验证展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面的蔗糖异构酶具有酶活力，为了进一步确定提升该酶的表达活力，本实验将通过基因工程的手段，将基因优化后的SI基因序列再次转化进入枯草芽孢杆菌，以期获得酶活力更高的蔗糖异构酶。

2.2研究手段

(1)DNA操作DNA的酶切、连接和转化大肠杆菌均按照分子克隆标准［9］方法进行。质粒DNA的小量制备、酶切产物回收均按试剂盒方法进行。(2)两步法转化枯草芽孢杆菌采用Spizizen法［10］制备B.Subtilis168感受态细胞，其中SpII中1CAYE所占的体积比由1%减少到0.1%。转化完毕后涂布在含10μg/mL红霉素的LB平板，过夜培养后进行筛选鉴定。(3)枯草芽孢杆菌的淀粉酶活性分析从平板上挑取单菌落点接在含1%淀粉的LB平板上，37℃培养12h以上，喷洒碘液。(4)芽孢悬浮液的制备采用DSM培养基作为枯草芽孢杆菌生产芽孢的诱导培养基，具体成分参见文献［8］。按1%接种量(V/V)转接至DSM培养基，37℃培养24h。收集菌体，分别用1mol/L的NaCl和KCl洗涤菌体，最后用无菌水悬浮，加入终浓度为5mg/mL的溶菌酶，于37℃处理2h除去营养细胞，离心去上清液。