除草剂苄嘧磺隆降解菌的分离鉴定及降解特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义：

磺酰脲除草剂是一类高效、广谱、低毒、高选择性的除草剂，有效的防除许多一年生或多年生杂草尤其是阔叶杂草。然而长期使用磺酰脲除草剂对生态环境造成了严重的破环，磺酰脲除草剂在土壤中主要通过化学水解，光解和微生物进行降解，而微生物降解起主要作用^[1]。

本课题拟通过微生物驯化与富集培养技术，分离得到苄嘧磺隆的高效降解菌株。利用高效液相色谱技术分析菌株对磺酰脲除草剂的降解效果。从而选取降解效果最好的菌株进行后续研究。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容：

1、研究目标：本课题通过微生物驯化与富集培养技术，从长期施用苄嘧磺隆的水稻田土样中分离苄嘧磺隆高效降解菌株。通过紫外分光光度计检测富集液中苄嘧磺隆降解情况。对获得的富集液进行反复传代，并利用选择性培养基对菌株进行分离。对分离的菌株进一步纯化后，用紫外分光光度计验证降解效果。通过16srdna序列分析以及系统发育树构建对苄嘧磺隆降解菌株进行鉴定。再利用lc-ms术分析菌株对苄嘧磺隆的降解途径，比较菌株对苄嘧磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆、胺苯磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆和甲嘧磺隆等7种磺酰脲除草剂的降解效果。从而选取得到降解效果最好的菌株进行后续研究。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

本课题通过微生物驯化与富集培养技术，从长期施用苄嘧磺隆的水稻田土样中分离苄嘧磺隆高效降解菌株。通过紫外分光光度计检测富集液中苄嘧磺隆降解情况。对获得的富集液进行反复传代，并利用选择性培养基对菌株进行分离。对分离的菌株进一步纯化后，用紫外分光光度计验证降解效果。通过16SrDNA序列分析以及系统发育树的构建对苄嘧磺隆降解菌株进行鉴定。再利用LC-MS分析菌株对苄嘧磺隆的降解途径，比较菌株对苄嘧磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆、胺苯磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆和甲嘧磺隆等7种磺酰脲除草剂的降解效果。从而选取得到降解效果最好的菌株、生长速度较快的菌株进行保存。

技术路线：

实验方案：

1.降解菌株的富集培养技术^[1]：在100mL浓度100mg/L苄嘧磺隆无机盐培养液中加入1g土样，30℃、170r/min摇床培养7d 后，吸取5mL转接至相同浓度的苄嘧磺隆富集培养液中，连续富集、转接5次。富集培养液经测定有降解效果后提高富集培养液中苄嘧磺隆的浓度至200mg/L，继续富集。转接5次经测定验证降解效果后，在200mg/L的苄嘧磺隆无机盐固体培养基平板上接入0.2ml富集液涂布，30℃培养，待平板上出现单菌落后，挑取单菌落转接至含苄嘧磺隆200mg/L的无机盐液体培养基试管中，30℃、170r/min摇培，验证单菌的降解效果。

2.16SrDNA的测序鉴定以及系统发育分析：16SrDNA含量大，分子大小适中，存在于所有的生物中，在结构与功能上具有高度的保守性，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故用于细菌分类鉴定分析。提取细菌的总DNA进行16SrDNA扩增。设计16SrDNA通用引物用PCR仪扩增16SrDNA片段。利用测序所得的16S rDNA在Eztaxon 网站(http://www.ezbiocloud.net/ eztaxon)进行序列比对。采用邻近法(Neighbor-Joining)用MEGA7.0构建系统发育树。

3.高效液相色谱法：磺酰脲类除草剂是一类非挥发性和热不稳定的化合物，适合用HPLC法进行残留分析^[2]。磺酰脲类除草剂一般在220-232nm范围内具有最大紫外吸收，也可用紫外检测器在255nm处进行分析。

液相色谱法^[3]：培养液以 10000×g 离心 5 min。收集上清液，用 0.5N 的 HCl 调节 pH 值到 4-5，加入 4 倍上清液体积的二氯甲烷，剧烈震荡 5min，静置 10min 待样品分层后，用尖嘴吸管吸弃上清液，底部有机相过无水硫酸钠柱，取 1.0mL 置于微量离心管中，室温下氮气吹干后加入 1mL 乙腈溶解(色谱纯)，经 Φ0.22m 滤器过滤后，密封低温(4℃)冷藏待测。 色谱条件：ThermoScientific Syncronis C18色谱柱（5 μm，250 mm × 4.6 mm）；流动相为乙腈/水（体积比60/40，添加0.5%乙酸）；流速1 mL/min；紫外检测器，检测波长255 nm；柱温40℃；进样体积20 L。

可行性分析：通过查阅相关文献了解该实验的背景并制定了完成实验的相关方法，确保了实验方法的科学可行。实验室配备有PCR仪、高速离心机、高效液相色谱等实验仪器，保证了实验的硬件操作条件。老师和师兄都有相关丰富经验，在实验过程中可以予以相关指导。我认为本实验可以成功进行。

[1] 周珊. 烟嘧磺隆降解菌的分离鉴定及降解特性研究[D]. 2015.

[2]Reiser RW, et al., Application of microcolumnliquid chromatography continuous flow fast bombardment MS in environmentalstudies of sulfonylurea herbicides J Chromatogr.1991.554:91-101.

[3]顾立锋. 胺苯磺隆降解菌SW4的分离、降解途径及其应用研究[D]. 南京农业大学, 2007.

研究方法：

本课题通过微生物驯化与富集培养技术，从长期施用苄嘧磺隆的水稻田土样中分离苄嘧磺隆高效降解菌株。通过紫外分光光度计检测富集液中苄嘧磺隆降解情况。对获得的富集液进行反复传代，并利用选择性培养基对菌株进行分离。对分离的菌株进一步纯化后，用紫外分光光度计验证降解效果。通过16SrDNA序列分析以及系统发育树的构建对苄嘧磺隆降解菌株进行鉴定。再利用LC-MS分析菌株对苄嘧磺隆的降解途径，比较菌株对苄嘧磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆、胺苯磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆和甲嘧磺隆等7种磺酰脲除草剂的降解效果。从而选取得到降解效果最好的菌株、生长速度较快的菌株进行保存。

技术路线：

实验方案：

1.降解菌株的富集培养技术^[1]：在100mL浓度100mg/L苄嘧磺隆无机盐培养液中加入1g土样，30℃、170r/min摇床培养7d 后，吸取5mL转接至相同浓度的苄嘧磺隆富集培养液中，连续富集、转接5次。富集培养液经测定有降解效果后提高富集培养液中苄嘧磺隆的浓度至200mg/L，继续富集。转接5次经测定验证降解效果后，在200mg/L的苄嘧磺隆无机盐固体培养基平板上接入0.2ml富集液涂布，30℃培养，待平板上出现单菌落后，挑取单菌落转接至含苄嘧磺隆200mg/L的无机盐液体培养基试管中，30℃、170r/min摇培，验证单菌的降解效果。

2.16SrDNA的测序鉴定以及系统发育分析：16SrDNA含量大，分子大小适中，存在于所有的生物中，在结构与功能上具有高度的保守性，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故用于细菌分类鉴定分析。提取细菌的总DNA进行16SrDNA扩增。设计16SrDNA通用引物用PCR仪扩增16SrDNA片段。利用测序所得的16S rDNA在Eztaxon 网站(http://www.ezbiocloud.net/ eztaxon)进行序列比对。采用邻近法(Neighbor-Joining)用MEGA7.0构建系统发育树。

3.高效液相色谱法：磺酰脲类除草剂是一类非挥发性和热不稳定的化合物，适合用HPLC法进行残留分析^[2]。磺酰脲类除草剂一般在220-232nm范围内具有最大紫外吸收，也可用紫外检测器在255nm处进行分析。

液相色谱法^[3]：培养液以 10000×g 离心 5 min。收集上清液，用 0.5N 的 HCl 调节 pH 值到 4-5，加入 4 倍上清液体积的二氯甲烷，剧烈震荡 5min，静置 10min 待样品分层后，用尖嘴吸管吸弃上清液，底部有机相过无水硫酸钠柱，取 1.0mL 置于微量离心管中，室温下氮气吹干后加入 1mL 乙腈溶解(色谱纯)，经 Φ0.22m 滤器过滤后，密封低温(4℃)冷藏待测。 色谱条件：ThermoScientific Syncronis C18色谱柱（5 μm，250 mm × 4.6 mm）；流动相为乙腈/水（体积比60/40，添加0.5%乙酸）；流速1 mL/min；紫外检测器，检测波长255 nm；柱温40℃；进样体积20 L。

可行性分析：通过查阅相关文献了解该实验的背景并制定了完成实验的相关方法，确保了实验方法的科学可行。实验室配备有PCR仪、高速离心机、高效液相色谱等实验仪器，保证了实验的硬件操作条件。老师和师兄都有相关丰富经验，在实验过程中可以予以相关指导。我认为本实验可以成功进行。

[1] 周珊. 烟嘧磺隆降解菌的分离鉴定及降解特性研究[D]. 2015.

[2]Reiser RW, et al., Application of microcolumnliquid chromatography continuous flow fast bombardment MS in environmentalstudies of sulfonylurea herbicides J Chromatogr.1991.554:91-101.

[3]顾立锋. 胺苯磺隆降解菌SW4的分离、降解途径及其应用研究[D]. 南京农业大学, 2007.

4. 研究创新点

本实验旨在选出高效的磺酰脲降解菌株。相比于前人的实验^[1][2][3]，本实验不止研究菌株对特定一种磺酰脲除草剂的降解效果，而是通过高效液相色谱比较该菌株对七种不同磺酰脲除草剂的降解效果。因为磺酰脲除草剂使用较为广泛，且在一片农田里可能会残留多种磺酰脲除草剂^[4]。如果筛选到一菌株能同时对多种磺酰脲除草剂都有降解效果，势必在实际应用中更有优势。

[1]周珊. 烟嘧磺隆降解菌的分离鉴定及降解特性研究[d]. 2015.

5. 研究计划与进展

研究计划：

2019年9月-2019年11月：查阅相关文献，制定相关的实验方案。同时着手从土壤样品中通过初筛和复筛的方法分离富集得到苄嘧磺隆降解菌。

2019年11月-2019年12月：对菌种的降解效果进行初步测定。