大豆CLC-b1基因的耐氯（盐）性功能分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义

土壤盐渍化(soil salinization)是指土壤底层或地下水的盐分随毛管水上升到地表，水分蒸发后，使盐分积累在表层土壤中的过程。中国盐渍土的类型多、分布全国，总面积约1亿hm²，由于气候、土壤的不合理灌溉、工业化生产等因素，我国的盐渍化土壤还在不断扩大[1]。因此土壤盐渍化导致植物受盐胁迫死亡，影响了作物耕种和植物栽培。植物受盐胁迫影响，导致生长抑制，光合作用下降，能耗增加，加速衰老，植物产量下降，甚至死亡[2]。盐胁迫的危害主要包含渗透胁迫、离子毒害、膜透性改变和生理功能紊乱，而离子毒害是盐胁迫的主要原因。离子毒害是指生化反应中的钠离子（na ）替换钾离子(k )以及钠离子和氯离子(cl^-)导致蛋白质构象发生变化的结果[3]。

现如今人们主要研究钠离子对植物生长的影响，而对于氯离子的研究则较少。虽然大部分植物受钠离子影响比氯离子深，但还有一些植物如大豆等对于钠离子而言受氯离子影响大。科学家通过研究植物对离子的吸收、运输和积累的途径来探究植物的耐盐性。植物吸收离子一般通过离子通道(ion channels)进行，离子通道包含阳离子和阴离子通道，阳离子通道研究较多，如钙离子(ga² )通道，而阴离子研究较少，如氯离子通道（chloridechannel,clcs）[2]。在研究氯毒害方向上，clc基因家族受到人们广泛关注。就高等植物而言，氯离子通道位于植物各种细胞器膜上，如质膜、液泡膜、内质网膜、线粒体膜、叶绿体膜等，因此氯离子通道一般被认为与细胞膨压及离子稳态、细胞内ph、养分运输、气孔运动、金属耐性、渗透调节、信号识别与转导等诸多功能有关[4]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

通过对大豆clc-b1基因研究的实践，分析该基因的在拟南芥中化学组织表达定位，进一步说明该基因在提高植物在耐氯（盐）方面的作用及其分子机理。在实践过程中，回顾和熟练掌握以往所学知识与技能，更进一步拓宽自身眼见，并学到额外知识，提升自我能力。

研究内容

3. 研究的方法与方案

研究方法

（1）花序侵染法：

在进行转化的前一天将拟南芥用营养液浇透, 选取同一时期花蕾较多的拟南芥进行转化, 转化时将野生型拟南芥的所有花序放入制备好的农杆菌浸染液中浸泡30 s;然后将花盆侧放到铺有湿润报纸的塑料托盘上;用黑色塑料袋对其进行遮光保湿16 h;后转移至光照培养箱中恢复至正常培养;1周后观察植株长势, 可对生长强壮的植株重复进行一次转化, 以提高转化率;转化5~6周后, 为了加速拟南芥种子的成熟可适量少浇营养液，待植株枯黄以后, 即可收取种子。

4. 研究创新点

课题充分体现了微生物学、微生物生理学、分子生物学、生物化学、植物学和植物生理学等多学科之间的相互渗透和交叉优势，是多种学科相关知识的大范围融合的一项科学研究课题。在功能基因组学、细胞器标记基因编码蛋白亚细胞共定位、表达载体构建、植物转基因 (根癌农杆菌诱导、发根农杆菌侵染) 等多种分子生物学和生理生化分析技术与方法的快速发展和技术成熟的情况下，本实验分析大豆CLC-b1基因在拟南芥中化学组织表达定位，来进一步说明该基因在提高植物在耐氯（盐）方面的作用及其分子机理。

5. 研究计划与进展

（1）2019年09月~2019年10月：熟悉实验室，查阅相关文献。得到superpcambia1300-gmclc-b1重组载体，转化并筛选转基因苗t3代纯合体。

（2）2019年10月~2019年11月：完成文献综述，构建p_{gmclc-b1::gus}重组载体，转化拟南芥。

（3）2019年11月~2020年2月：筛选阳性拟南芥幼苗，进行gus染色分析基因在拟南芥根茎叶的定位，对鉴定出来的转基因t3代纯合子拟南芥，进行相关生理指标的测定：发芽率，根长，以及苗的鲜重比较，株高，叶片相对含水量，叶绿素荧光，叶片电导率，cl^- ,na , no₃^-和k 在叶和根中浓度的动态改变。