1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)隶属于隶属于绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、小球藻属，是一种球形单细胞淡水藻。自20世纪50年代以来，世界各国相继开始小球藻的培养和营养价值的研究，目前已经有了系统的大规模生产方式，将小球藻应用于食品、医药及化妆品等行业。小球藻比表面积大光合效率高，含有多糖、蛋白质、细胞色素、不饱和脂肪酸和生长因子等多种丰富的营养物质，是一种有重要意义的藻类。
本课题内容为研究蛋白核小球藻的异养-光自养串联培养。目前实验室蛋白核小球藻采用的是异养发酵培养模式，培养出来的小球藻液主要用于水产生物饵料，现异养培养技术相对成熟，且已获得初步的饵料产品。由异养培养得到的饵料藻还未真正投入使用，饵料藻在投入养殖水塘中使用时存在一个分裂繁殖的过程，从某种意义上讲，也属于藻的二次培养。不过培养方式与藻的异养有区别，此为藻的光合自养过程。因此本课题意义在于研究藻细胞由异养环境转向光合自养环境后如何能够快速适应环境的变化，并维持藻细胞活性，提高藻细胞的抗逆性。此外，目前实验室异养培养所得的饵料藻细胞蛋白质、色素等营养物质含量与市场上的同类产品相比不具优势。已有相关文献报道，自养培养的藻细胞中蛋白质含量要高于异养培养，因此，通过自养培养阶段优化培养基组分的方式来提高饵料藻细胞中蛋白质的含量也是本课题的意义之一。
2. 研究的基本内容和问题
1. 研究目标：
(1) 考察饵料藻由异养环境向自养环境转变的适应能力，提高饵料藻细胞活性；
(2) 通过自养培养阶段的营养调整，改善饵料藻细胞内营养物质含量，提高市场竞争力，增加其使用效价；
3. 研究的方法与方案
1. 研究方法
蛋白核小球藻饵料的模拟培养实验采用平行分组培养的方法；蛋白核小球藻饵料的自养培养实验，其中培养条件优化实验采用单因素和正交结合的方法以获得较佳的培养工艺参数；培养基优化实验主要采用单因素的方法确定培养基中某组分的含量，以提高藻细胞中的蛋白含量。
藻密度测定方法：721型紫外-可见分光光度计
藻形态测定方法：电子显微镜
藻蛋白含量测定方法：总有机碳分析仪测定法
2. 技术路线
3. 实验方案
3.1 实验对象
蛋白核小球藻FACBH-10，购自武汉水生生物研究所中国淡水藻种库。
3.2 实验材料及设备
(1) 实验材料
| 试剂名称 | 规格 | 等级 | 生产厂家 |
| glucose | 500g/瓶 | AR | 国药集团化学试剂有限公司 |
| KNO3 | 500g/瓶 | AR | 上海凌峰化学试剂有限公司 |
| KH2PO4 | 500g/瓶 | AR | 上海凌峰化学试剂有限公司 |
| K2HPO4 | 500g/瓶 | AR | 上海凌峰化学试剂有限公司 |
| MgSO4.7H2O | 500g/瓶 | AR | 国药集团化学试剂有限公司 |
| CaCl2.2H2O | 500g/瓶 | AR | 上海凌峰化学试剂有限公司 |
| FeSO4.7H2O | 500g/瓶 | AR | 国药集团化学试剂有限公司 |
| H3BO3 | 500g/瓶 | AR | 上海凌峰化学试剂有限公司 |
| ZnSO4.7H2O | 500g/瓶 | AR | 国药集团化学试剂有限公司 |
| MnCl2.4H2O | 500g/瓶 | AR | 上海凌峰化学试剂有限公司 |
| Na2MoO4 | 500g/瓶 | AR | 上海凌峰化学试剂有限公司 |
| CuSO4.5H2O | 500g/瓶 | AR | 上海凌峰化学试剂有限公司 |
| Co(NO3)2.6H2O | 100g/瓶 | AR | 国药集团化学试剂有限公司 |
| HNO3 | 500ml/瓶 | AR | 国药集团化学试剂有限公司 |
(2) 实验设备
| 试剂名称 | 型号 | 生产厂家 |
| 灭菌锅 | G154DWS | ZEAIWAY |
| 恒温光照摇床 | 211GZ | 上海欧蒙事业有限公司 |
| 净化工作台 | Sentinel | SCIENTIFIC |
| 电子天平 | JA2603B | 上海精密科学仪器有限公司 |
| 离心机 | TG16-WS | 湘仪离心机仪器有限公司 |
| 50L发酵罐 | Biotech | 镇江汇森生物设备有限公司 |
| 恒温光照培养箱 | MGC-300A | 上海一恒科学仪器有限公司 |
| 低温冰箱 | BCD-226SJP | 青岛海尔 |
| 电子显微镜 | CX31 | OLYMPUS |
| 流式细胞仪 | BD AccuriTM C6 | 赛默飞世尔科技有限公司 |
| 总有机碳分析仪 | TOC-L CNP CN200 | 岛津 |
| 紫外-可见分光光度计 | 721 | 上海普析 |
3.3 实验过程
3.3.1 蛋白核小球藻模拟培养实验
分别取自来水、BG-11培养基（培养基组分如表1所示）、养殖塘水各200ml于250ml锥形瓶中，然后再分别取100ml BG-11培养基和100ml养殖塘水于500ml锥形瓶中。每瓶接种饵料藻130ul，然后置于摇床上光照培养，转速120rpm，温度26℃，每天取样测OD680值进行分析。
表1 BG11培养基
| 药 品 | 用量mg/L |
| NaNO3 | 1.5 |
| MgSO4.7H2O | 0.075 |
| K2HPO4 .3H2O | 0.04 |
| CaCl2 . 2H2O | 0.036 |
| Na2CO3 | 0.02 |
| Citric acid | 0.006 |
| Ferric ammonium citrate | 0.006 |
| EDTA | 0.001 |
| A5 solutiona | 1ml |
| Distilled water | 1000ml |
注: A5 solution组成为MnCl2.4H2O, 181mg/L; ZnSO4.7H2O, 22mg/L; H3BO3, 286 mg/L;
CuSO4.5Hz0, 7.9 mg/L; (NH4)6Mo24.7H2O, 3.9 mg/L。
3.3.2 蛋白核小球藻自养实验
3.3.2.1培养参数优化实验
蛋白核小球藻异养发酵培养工艺通过前期的工作已获得优化，所以本次主要对自养培养条件进行优化，自养培养基暂定为BG11培养基，培养基组分如表1所示。影响蛋白核小球藻饵料异养转自养的因素有很多，如培养温度、光照强度、pH及搅拌速度、培养时间等，所以首先采用单因素实验，以确认每个影响因素的最佳值范围，然后再采用正交实验，检验各因素间的相互作用，从而获得一条较佳的培养工艺路线。
实验以异养发酵所得饵料藻作为藻种，按照一定的比例接种到BG11培养基中，然后按照实验所设置的条件进行培养，培养期间定期检测饵料藻在680nm处的吸光度值，监测藻细胞的生长情况，以最终的藻密度大小作为标准来评判各组实验组的结果。
(1) 单因素实验
通过单因素实验来确定影响蛋白核小球藻异养转自养的因素最佳取值范围，为正交实验提供数据参考，单因素水平如表2所示：
表2 单因素水平表
| 因素 | 水平 | ||
| -1 | 0 | 1 | |
| 接种比例(X1) | 1:800 | 1:1200 | 1:1500 |
| 培养温度℃(X2) | 26 | 28 | 30 |
| Ph(X3) | 6.5 | 6.8 | 7.2 |
| 转速rpm(X4) | 100 | 150 | 200 |
(2)正交实验
在单因素实验的基础之上进行正交实验设计，考察每个因素之间的相互作用，然后获得最佳的培养参数。
表3 正交实验表
| 因素 | 接种比例（X1） | 培养温度℃(X2) | Ph(X3) | 转速rpm(X4) |
| 实验1 | -1 | -1 | -1 | -1 |
| 实验2 | -1 | 0 | 0 | 0 |
| 实验3 | -1 | 1 | 1 | 1 |
| 实验4 | 0 | -1 | 0 | -1 |
| 实验5 | 0 | 0 | 1 | -1 |
| 实验6 | 0 | 1 | -1 | 0 |
| 实验7 | 1 | -1 | 1 | 0 |
| 实验8 | 1 | 0 | -1 | 1 |
| 实验9 | 1 | 1 | 0 | -1 |
采用Design expert对表3的实验结果数据进行统计分析，得出最佳的因素水平组合。同时也可得到各因素的偏回归系数及显著性，可根据实验条件及结果考虑是否需要进一步的优化因素水平。
3.3.2.2模拟培养实验
通过培养条件优化所得的高活性饵料藻再次按照饵料藻在养殖水塘使用时的条件进行模拟培养实验，实验设置与操作同6.1。
3.3.2.3培养基优化实验
有文献报道NO3-离子的浓度对小球藻细胞生长及藻体蛋白质含量的影响较大，故采用以上优化所得的培养参数条件，通过优化BG-11培养基中NaNO3的含量来提高藻体蛋白含量。初步预设NaNO3的添加水平为：1.5g/L、3.0g/L、4.5g/L、6.0g/L，其他培养组分不变，培养一段时间后取样测藻体蛋白含量。
4. 可行性分析
微藻的营养模式包括光自养、异养和混养（兼养），与之对应的培养方式包括光自养培养、异养培养和混养培养。蛋白核小球藻作为一种微藻，既可以利用光照（自然光照或人工光照）和无机物（水、无机盐和CO2）进行光合作用，合成有机物，维持自身生长。又可以在暗黑的条件下，以环境中的有机物作为能源物质，维持自身代谢。还可以既利用CO2进行光合作用，又利用有机化合物来维持自身生长。此外，蛋白核小球藻适应能力极强，能够较快地改变自身的代谢方式以适应外界的生活环境。目前已有大量的文献来研究蛋白核小球藻饵料光照自养及发酵异养的生理生化状况，且已有相关企业成功应用了小球藻饵料异养转自养的培养方法。所以将蛋白核小球藻的异养培养和自养培养同时串联起来也是可行的，只是培养方式转变之间的适应过程。
4. 研究创新点
对自养培养阶段进行了营养调整、优化培养基组分，提高了饵料藻细胞中蛋白质的含量，改善了饵料藻细胞内营养物质含量，增加了其使用效价。
之后进一步对微藻传统培养工艺进行改良，改良为异养-光自养串联培养工艺，克服了传统微藻培养时异养和光自养单独培养的缺点，提高饵料产品产量的同时，改善了饵料藻品质，为后期真正实现饵料藻的规模化培养做铺垫。
5. 研究计划与进展
第一阶段：（2020.3.28－2020.4.9）：资料收集、整理，确定论文的写作思路，技术路线，论文提纲，方法和应用。
第二阶段：（2020.4.10－2020.4.20）：完成论文的前言和试验方法部分。
第三阶段：（2020.4.21－2020.5.1）：完成论文的结果与讨论以及结论部分。
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