1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题意义：
沙雷氏菌（serratia sp.）又称灵杆菌，是一种广泛分布于水和土壤等环境及食物中的兼性厌氧菌，能产生非水溶性红色素的革兰氏阴性细菌。一般存在于土壤、水、植物、动物以及人类的肠道和呼吸道中。粘质沙雷氏菌产生的灵菌红素具有多种生物活性，例如抗癌，抗霉，免疫抑制等。
本课题研究的沙雷氏菌fs14中的10125是一种组氨酸激酶，而组氨酸激酶是双组分调控系统的一个组分。因此再介绍双组分系统。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
将沙雷氏菌fs14中组氨酸激酶10125全长及膜外部分进行表达纯化。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
用PCR扩增目的DNA；
用限制性内切酶及连接酶构建含目的蛋白编码基因的表达载体，运用DNA测序进行鉴定
用一步转化法将表达载体导入宿主菌；
SDS-PAGE电泳跑胶检查目的基因是否表达；
用亲和层析法和凝胶过滤层析法进行蛋白的分离纯化；
用蛋白质晶体座滴法筛选蛋白的结晶条件；
技术路线：
| PCR获取目的基因 |
| 目的基因连接表达载体 |
| 重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞 |
| 挑取正确转化子提取质粒并鉴定正确的重组质粒 |
| 转化正确的质粒至大肠杆菌或野生型FS14中 |
| 诱导表达 |
| 表达优化 |
| 分离纯化 |
| 获得有活性的目的蛋白 |
实验方案：
1. PCR获取目的基因
以沙雷氏菌基因组为模板进行PCR，获得目的基因。
2. 目的基因连接表达载体
将含有目的基因的片段进行酶切，灭活后连接表达载体。
3.重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞
将连接后的片段转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布培养。
4. 挑取正确转化子提取质粒并鉴定正确的重组质粒
选取长势较好的菌株接入液体培养基培养，通过碱裂解法提取质粒，并进行凝胶电泳检测。
5. 正确的质粒转化至沙雷野生型FS14
通过一步转化法将重组质粒转入沙雷野生型FS14。
6. 诱导表达
用IPTG为诱导剂对其进行诱导表达，通过SDS-PAGE检测诱导产物。
7. 表达优化
优化蛋白的表达条件例如生长时期，IPTG浓度、诱导温度，最终得到表达量大的蛋白的表达条件。
8. 分离纯化
用亲和层析方法进行初步分离纯化，再用凝胶过滤层析进行进一步纯化，获得有活性且较纯的目的蛋白
可行性分析：
（1）实验技术方法成熟：
项目指导教师在分子生物学、蛋白组学等研究方面积累了丰富经验，实验技术方法成熟。本项目的研究计划已经划分，步骤详细切实可行，工作量适中，可以在一年内完成课题，并完成结题报告。
（2）试验条件与设备齐全：
具备本项目实施所需的各种实验技术方法及实验设备，实验条件成熟。
4. 研究创新点
创新点：
本实验对象选取沙雷氏菌里的组氨酸激酶10125，通过筛选，得到含有该组氨酸激酶的菌株，研究其在本体中的过表达情况，获得目的蛋白后初步探究其结晶条件，为晶体学结构研究奠定基础。
在技术研究上，涉及微生物学、分子生物学等学科知识，体现了交叉学科研究特点。
5. 研究计划与进展
2019年10月-2019年12月，查阅资料、文献；学习和熟悉基本实验操作。
2019年1月-2019年3月，组氨酸激酶10125全长及膜外部分基因的过表达。
2019年4月-2019年5月，对组氨酸激酶的分离纯化。
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