V-ATPase复合体亚基Vph1和Stv1调控细胞自噬的机制研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 v-atpase调控细胞自噬的机制研究

1．1 v-atpase复合体

v-atpase是真核生物中高度保守的质子转运复合物，它普遍存在于从酵母到哺乳动物等各类真核生物膜系统上^[1]。它是一种依赖于atp的质子泵，能够逆浓度梯度地将质子泵入细胞器，从而维持液泡（或溶酶体）、高尔基体、吞噬小泡等细胞器的酸性环境。这对液泡（或溶酶体）的消化功能、高尔基体加工蛋白质及小分子的耦合传输、膜的转运等生理活动是十分必要的^[2]。

2. 研究的基本内容和问题

v-atpase在酵母液泡膜上广泛存在，是液泡膜的一个组成成分。

其功能是主要负责液泡腔内的酸化，维持液泡环境的稳态和机体的酸碱平衡，为生物体正常的生理活动提供了一个必要的条件。

细胞自噬过程中，液泡是自噬体的降解场所，并且自噬小体的降解过程依赖于液泡的酸性和液泡内各类水解酶。

3. 研究的方法与方案

研究方法与实验方案

（1）证明v-atpase复合体亚基的缺失对细胞自噬的影响来源于液泡酸碱度的变化

先利用基因重组的方法敲除酿酒酵母的atg1、pep4、stv1、vph1基因，再导入质粒pcrosella，饥饿后，在荧光显微镜下检查绿色和红色荧光。

4. 研究创新点

利用pcRosella直接证明V-ATPase复合体亚基的缺失对细胞自噬的影响来源于液泡酸碱度的变化。

pcRosella是一种穿梭质粒，由于其具有增强子和强启动子，其在酵母菌细胞中均能大量表达。pcRosella的表达产物是串联在一起的酸稳定的红色荧光蛋白和酸敏感的绿色荧光蛋白，在缺氮培养基中饥饿处理时，过量表达的两种荧光蛋白会被运送至酿酒酵母液泡中降解，若是因为相关基因的敲除破坏了V-ATPase的活性，也就是V-ATPase不能为液泡创造出酸性的环境，则在液泡中能够观察到绿色荧光；而在野生型中，由于V-ATPase的为液泡创造出酸性的环境，则在液泡中不能观察到绿色荧光。

5. 研究计划与进展

2017.1-2017.2 阅读相关的文献，详细了解研究背景和相关实验技术方法，制定详尽的实验方案；

2017.2-2017.3 获得酿酒酵母的wt、atg1Δ、pep4Δ、stv1Δ、vph1Δ、stv1Δvph1Δ菌株，转入pcrosella；

2017.3-2017.4 将野生型酿酒酵母的pep4基因标记上绿色荧光蛋白；获得标记了绿色荧光蛋白的wt、atg1Δ、stv1Δ、vph1Δ、stv1Δvph1Δ菌株；