西维因降解菌株A-1的分离及其西维因降解途径研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题研究意义

1. 1西维因介绍

西维因属于中等毒性的氨基甲酸酯类农药，具有氨基甲酸酯类农药的优点，在我国广泛应用于谷物、蔬菜、水果等农作物的病虫害防治。西维因的过量使用不仅造成了环境污染，同时由于食物链的传递，在动物性来源食品中也存在严重的残留现象，从而严重危害人体健康。

西维因（分子结构见附件）纯品为白色结晶，难溶于水，易溶于丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈等有机溶剂，在碱性和高温条件下很易被水解为1-萘酚^[1]。William^[2]等对西维因的风险评估中指出，西维因在pH值为5的水体中稳定，pH值为7的水体中的半衰期为12天。

西维因的杀虫作用机制为抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性来达到杀虫效果，由于人类和其他非靶标动物体内也具有AChE，所以西维因也会对其他非靶标动物造成危害。

1.2本课题的意义

由于该类农药大面积、持续地使用，其在环境中的残留会对人类健康和生态环境的平衡产生潜在的威胁。以生物降解方式处理环境中残留的西维因污染是一种环境友好型的处理方式，具有彻底、高效、不会产生二次污染等优势，选择恰当的微生物作为材料，可以将西维因降解为H2O、CO2等低毒或无毒的物质，从而降低环境中污染物的浓度，以减轻其危害。

本课题针对长期施用西维因的土壤，分离筛选降解西维因的菌株，研究其生物学特性和降解特性，可以为其在生物修复中的应用提供理论依据，从而为我国的环保事业做出贡献。对菌株的培养基条件进行优化，提高菌株生长量，并对以后可能的菌株大量生产提供理论基础。

2.国内外的研究进展

目前，国内外在西维因微生物降解方面已经做了许多工作，概括起来主要包括降解菌的分离及其降解特性；降解途径的解析；降解酶的特性和降解相关基因克隆这四个层面。

2.1降解菌的分离及其降解特性

目前国内外从各种环境中分离得到西维因降解菌的代表菌株。从表中可以看出大多数降解菌来自于假单胞菌属（Pseudomonas）和鞘胺醇单胞菌属（Sphingomonas）。

在这些菌株中，Swetha等^[7]分离的三株假单胞菌C4、C5和C6都能利用西维因为唯一碳源生长，关于这三株菌的研究也比较系统。本课题组一直从事西维因微生物降解方面的研究。2007年，严秋香分离到三株西维因降解菌Novosphingobium sp. FND-3，Pseudomonas sp. X3和Sphingobium sp. X23，其中菌株X3能够以西维因为唯一碳源生长^[20,21]。2010年，夏亚丽分离到两株西维因降解菌Sphingobiumsp. FX-1和 Rhizobium sp. X9，其中Rhizobium sp. X9能以西维因为唯一碳源生长，且能完全降解西维因^[16]。

2.2降解途径的解析

Sud, R. K^[15]分离无色杆菌属(Achromobacter sp.) 的西维因降解菌，通过色谱分析在代谢产物中检测到1-萘酚、对苯二酚、邻苯二酚和丙酮酸盐，且菌株可以以邻苯二酚为唯一碳源生长。Larkin, M. J.^[5]分离的假单胞菌属12043和 Hayatsus M^[14]分离的节杆菌属(Arthrobacter) RC100都可以以西维因为唯一碳源，通过水解西维因得到1-萘酚，1-萘酚又被水解为水杨醛、水杨酸，再通过龙胆酸途径进一步降解。不同于无色杆菌RC100不能以利用邻苯二酚，推测RC100降解1-萘酚的途径不同于无色杆菌。

Swetha VP^[17]分离的三株假单胞菌C4、C5和C6能够利用西维因为唯一碳源和能源并推测完整的降解途径。西维因首先水解为1-萘酚，然后1-萘酚在邻位发生羟化反应生成1,2-二羟基萘，它通过双加氧酶作用生成2-羟基苯亚甲基丙酮酸，然后醛缩生成水杨醛，再氧化成水杨酸，再羟化为龙胆酸，进而开环生成马来酰丙酮酸，再经过一系列反应直至进入三羧酸循环，最终生成二氧化碳和水。（代谢途径见附件）

已知的西维因水解酶基因有两种，分别为cehA和cahA。而1-萘酚羟化反应催化酶的基因目前仍无报道。

Hashimoto M^[11]从Rhizobium sp.AC100中通过质粒消除的方法验证水解酶基因在质粒上，该水解酶能水解乙酸萘酯和4-硝苯基乙酸酯推测该水解酶为酯酶。通过建库、回复突变的方法得到一个2.3 kb的cehA基因。cehA基因的前后两端是两个完全相同的IS序列，说明此基因在土壤中也可能有水平转移的功能。

Hashimoto M^[11]从Achromobacter sp.RC100纯化了一个西维因水解酶，通过鸟枪法建库得到大小为1518 bp的cahA基因，该基因位于RC100的质粒pRC1上。cahA基因可再大肠杆菌JM109中大量表达，其表达产物仅能水解酰胺类化合物，不能水解其它的氨基甲酸酯类化合物。经过实验证明该酶是一种酰胺酶。

对于从不同菌株中纯化的西维因水解酶进行生物化学和酶学特性方面的研究，可以发现它们各不相同(表2)。

此外，Swetha^[7]等，Sah^[18]等和Trivedi^[19]等分别于2007年，2011年和2014年分别从三株假单胞菌C4、C6和C5中都纯化出将1-萘酚转化为1,2-二羟基萘的1-萘酚2-羟化酶，它们虽然都属于以FAD为辅基的黄素单加氧酶，都是同型二聚体，亚基的大小都为66 kDa。但是，三株菌中的1-萘酚2-羟化酶在N-末端序列、FAD含量和Ki方面不同。

3.应用前景

本课题对所分离的西维因降解菌株进行生物学特性的研究并对培养基条件进行优化，为其进行大规模快速生产提供了理论基础。为降解西维因提供可行的方法，为我国环保事业做出贡献。

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2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

本课题针对长期施用农药西维因及生产农药西维因工厂附近的土壤，经富集培养分离筛选得到能够降解西维因的菌株，研究其降解特性和生物学特性，为更好地利用微生物降解西维因提供理论和实验基础。

2.研究内容

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

1.1西维因降解菌的分离

取长期受西维因污染的土壤分离可降解西维因的菌株。

4. 研究创新点

本研究课题对从环境中分离的西维因降解菌进行较全面的生物学特性及降解特性研究，并探究其降解途径和相关酶的特性，为后续深入研究奠定基础。

5. 研究计划与进展

本项目计划一年内完成

2016.9-2017.1 查阅文献，设计实验步骤，拟定实验计划

2017.1-2017.5 正式实验