EI/EF鹅观草体系蛋白质组差异的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）1 本课题研究意义1.1内生真菌研究表明，一些真菌的生活史的一部分或全部能侵染并定殖在植物组织器官中，宿主无明显感染症状，这类真菌就是内生真菌（endophyte）。

这些真菌在培养基上对植物病原具有明显的拮抗作用，能增强植物的抗虫、抗旱、抗病、抗寒能力，促进肥料吸收，促进植物生长和分蘖、增产等，有时也会使宿主植物生产过量的生物碱，造成家畜中毒等不良现象[1]。

研究内生真菌的作用机理，不仅有助于我们克服其负面影响，也有助于我们更好的开发其未发现或不能为我们所用的作用。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究的目标（1）研究ei/ef鹅观草蛋白质表达的差异。

（2）进一步延伸到逆境胁迫下，其蛋白表达差异。

（3）利用质谱测序，鉴定出差异蛋白，以此找到内生真菌与宿主植物之间的相互作用机理，以及进一步阐明含有内生真菌的植物其抗逆的机理。

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析1 研究方法本次实验主要是运用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，研究ei/ef植物蛋白质组差异，如果条件允许的话，进一步利用质谱技术，对其蛋白质组的差异进行进一步的研究。

从而，一方面我们想找到一套适用于鹅观草蛋白质组分析的双向电泳技术，另一方面是通过蛋白质组的研究找到内生真菌与宿主植物互作以及抗逆的作用机理。

2 实验流程 2.1 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的具体实验流程（1）溶液的配置蛋白提取液：10%tca丙酮溶液（w/v）、0.07%β-巯基乙醇样品裂解液：7mol/l尿素、2mol/l硫脲、4%chaps、65mmol/ldtt水化上样缓冲液：尿素7m、硫脲2m、chaps4%、dtt65mm、bio-lyte0.2%（w/v）、溴酚蓝0.001%、milliq水平衡缓冲液：母液6m、sds2%、tris-hcl0.375mph8.8、甘油20%、milliq；水平衡缓冲液Ⅰ：母液10ml、dtt0.2g现配现用；平衡缓冲液Ⅱ：母液10ml、碘乙酰胺0.25g、现配现用12%分离胶：milliq水99 ml、10%sds 75 ml、1.5mol/ltris（ph8.8）75ml、 30%聚丙烯酰胺储液120ml、 10% ap 3ml、 temed 0.12ml10 电极缓冲溶液：tris 30 g、甘氨酸144 g、 sds 10 g、 milliq 定容至1 l（2）鹅观草叶片总蛋白提取恶官操叶片蛋白质提取采用尿素/硫脲法， 1 g 恶官操液氮研磨成粉溶于8ml 蛋白质提取液中，-20℃静止过夜，次日20000g，4 ℃下离心30 min，弃上清，加8ml蛋白提取液，震荡混合，-20 ℃静止1h，同上离心，重复洗涤沉淀3~4次至蛋白纯白色，室温放置1h，加蛋白裂解液4~5ml，-20℃冰箱保存，超声破碎。

4. 研究创新点

以鹅观草为研究材料，利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术来研究其蛋白质组学，从而希望找到内生真菌与宿主植物相互作用以及含菌植物抗逆的机理。

刚途径与方法在国内基本还无人踏及。

可以说是一个新的思路以及小领域。

5. 研究计划与进展

1 研究计划：2017年12-1月：对EI/EF鹅观草的进行双向电泳，找到其中的差异蛋白;2017年2-3月：对逆境胁迫下EI/EF鹅观草的进行双向电泳，找到其中的差异蛋白；2017年3-4月：如果前面双向做的比较成功，成功找到其中的差异蛋白，则继续继续将差异蛋白送去进行质朴测序，鉴定出蛋白；2017年4-5月：以鉴定出的蛋白为基础，进一步探究内生真菌与宿主互作的机理以及含菌植物抗逆的机理2017年5-6月：撰写论文2 预期进展找到EI/EF鹅观草以及逆境胁迫下EI/EF鹅观草的差异蛋白，从而以此探究出内生真菌与宿主植物相互作用以及含菌植物抗逆的机理。

并希望在此过程中，对现有的适用于其他植物蛋白差异研究的双向电泳技术进行改良，从而形成一套适用于鹅观草蛋白分析的双向电泳技术。