灵芝中合成内源硫化氢关键酶的基因克隆及其沉默菌株的构建开题报告

1 本课题研究意义

1.1 H₂S的生理功能

1.1.1 H₂S在动物中的生理功能

①H₂S在心血管系统中可以舒张平滑肌，舒张血管，降低血压，并且NO可以协同增强此效应^[1]。H₂S的前体物质NaHS与H₂S一样，作用程度与浓度有关，表现为：低浓度反映速率缓慢，高浓度则反映加速、剧烈。②体内如果存在H₂S并对其进行一定的电刺激，则会引发海马长时程增强(long-term potentiation，LTP)效应。③动物体内丝裂原激活的蛋白激酶介导了平滑肌增生，而H₂S的存在可能抑制了这种途径。④体内H₂S的存在还可能对心血管疾病以及呼吸系统疾病有积极的意义。

1.1.2 H₂S在植物中的生理功能

①植物体内H₂S及其前体NaHS的存在可以诱导植物叶片气孔的关闭，从而减少水分蒸发，面对干旱有更强的抗逆性^[2]。②植物体内H₂S和NaHS还能缓解重金属离子对植物的毒害作用同时还能缓解氧化作用的带来的伤害。③对干旱条件下的植物施用NaHS能促进地上地下部分的生物量，增加叶片中的叶绿素含量，从而延长幼苗的存活时间。除了增加叶绿素含量外，H₂S还能增加抗氧化酶的活性来改变过氧化氢含量来缓解渗透胁迫^[3]。④对植物施加低浓度的H₂S可使根尖边缘细胞增多、根尖组织可溶性蛋白增加、粘胶层相对面积减小，从而促进植物根的生长。⑤植物体内的H₂S还具有延长花期以及延缓衰老的功效。

1.1.3 H₂S在微生物体内的生理功能

①微生物将H₂S转化成硫酸盐并释放ATP，来达到其固定CO₂的目的。②非放氧型光合细菌能以光能作能量，H₂S作供氢体来固定CO₂。③微生物能还原出H₂S，使之与环境中的铁矿石反映，使铁元素溶解，能更好的被生物吸收利用。④H₂S还能通过还原蛋白质中的二硫键^[4]、与辅基结合、刺激ROS产生的途径来抑制其他敏感生物的生长。

2.国内外研究概况

动物体内产生内源性H₂S的途径有很多种，下面举例介绍两种，第一种是：细胞质中是以L-半胱氨酸（L-cysteine，L-Cys)为底物，在胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）的催化下产生的。第二种产H₂S的途径则是在线粒体内，该种途径以β-巯基丙酮酸为底物，在巯基丙酮酸转硫酶（mercaptopyruvate transsulphurase，MPST）的作用下产生H₂S^[5]。

在植物体内, H₂S合成主要有L-半胱氨酸脱巯基酶(LCD)途径、D-半胱氨酸脱巯基酶(DCD)途径、亚硫酸还原酶(SiR)途径、氰丙酸合成酶(CAS)途径、半胱氨酸合成酶(CS)途径等。

兼性厌氧菌产生H₂S的方式有两种，一种是同化硫酸盐产生H₂S，这种产量少并且很容易被同化成有机含硫化合物；另一种通过降解半胱氨酸产生H₂S，这种方式产量较大，为主要方式^[6]。

3.应用前景

细菌 H₂S 产生机理及生理功能的阐明不仅可为硫元素生物地球化学循环规律的揭示提供依据，有利于自然环境的保护和污染生态系统的修复，而且可为好氧性微生物的控制提供有益的参考， 有利于病原细菌和腐败菌的防治。鉴于硫化氢与一氧化氮具有相似的生理学功能，腹腔注射硫化氢溶液可有效预防实验动物的高血压、胃肠道溃疡等多种疾病^[7]，还有望开发出硫化氢产生酶制剂或微生态制剂（如将硫化氢产生酶基因克隆到乳酸菌中），用于相关疾病的预防。

已有的研究表明，内源性H₂S参与了许多方面的生理及病理过程。但毕竟研究时间太短，目前的研究主要集中在心血管循环系统及神经系统，H₂S在消化系统、生殖系统等其他方面的研究鲜有报道。H₂S是否在其他系统起着生理及病理作用以及起何种作用有待于深入的研究。另外，目前的研究主要针对人类疾病病理方面，一般应用大鼠实验动物模型，在动物疾病及应用其他动物模型的研究基本未见报道。

H₂S可诱导植物的耐热性, 并且这种耐热性的形成可能与H₂S诱导的抗氧化系统活力的增强、渗透调节物质的积累和热激蛋白的合成等有关。此外, 在H₂S诱导的植物耐热性形成过程中存在H₂S与其他信号分子如NO、CO、H₂O₂、Ca² 、ABA、SA的互作。但是, H₂S作为信号分子,其诱发的胁迫耐性包括耐热性的相关机制有待于进一步阐明。

参考文献：

[1] Hosoki R,Matsuki N,Kimura H．The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous smooth muscle relaxant in synergy with nitric oxide[J]．Biochem Biophys Res Commun，1997,237(3):527-531．

[2] Garca-Mata C et al. Hydrogen sulfide, a novel gasotransmitter involved in guard cell signaling. New Phytol, 2010, 188: 977-984.

[3] 崔为体,沈文飚. 植物中硫化氢的生理功能及其分子机理[J]. 生命的化学,2012,04:385-389.

[4] Nagy P. Kinetics and mechanisms of thiol-disulfide exchange covering direct substitution and thioloxidation-mediated pathways. Antioxidants Redox Signaling, 2013, 18: 1623-1641.

[5] 周辉,高洪,严玉霖,周铭涛,肖鹏. 内源性气体信号分子H_2S研究进展[J]. 动物医学进展,2009,06:94-97.

[6] Luhachack L, Nudler E. Bacterial gasotransmitters: an innate defense against antibiotics.Current Opinion in Microbiology, 2014, 21:13-17.

[7] Wang R. Physiological implications of hydrogen sulfide: A whiff exploration that blossomed.Physiological Reviews, 2012, 92: 791-896.

1. 研究方法

1.1反对比法筛选关键酶基因

将参考文献中的可能相关的酶在灵芝库中进行比对，筛选出可能的基因序列，将基因序列在NCBI中进行BLAST，得到一系列相关的酶，逐个比对种属、特性，从而进一步确定关键酶基因

1.2 QRT（荧光定量PCR）技术筛选关键基因

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析

1.3基因克隆技术

DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。

步骤：

1.3.1目的DNA片段的获得

1.3.2载体的选择

1.3.3体外重组

1.3.4重组子的筛选

1.4 RNAi干扰技术

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

步骤：

1.4.1 基因引物的设计

1.4.2 构建沉默载体

1.4.3 构建沉默菌株

2. 技术路线

2.1 参考文献将酶在灵芝库中比对出基因序列

2.2 进一步筛选基因序列

2.3 对筛选出的基因序列进行基因克隆

2.4 克隆的关键基因设计基因引物

2.5 构建沉默载体

2.6 构建沉默菌株

3. 实验方案

3.1将动物、植物、微生物中与合成内源硫化氢有关的酶在灵芝库中比对出基因序列

3.2 将比对出的基因序列在NCBI中BLAST出与此基因序列相关的酶，考察这些酶的种属、特性，剔除、筛选出基因序列

3.3 筛选出的基因序列进行QRT（荧光定量PCR）技术

常状态和热胁迫状态两种条件对灵芝进行刺激，观察转录倍数，从而确定关键基因

3.4 对关键基因进行基因克隆

3.4.1目的DNA片段的获得

3.4.2载体的选择

3.4.3体外重组

3.4.4重组子的筛选

3.5 RNAi干扰技术

3.5.1 对克隆出的关键基因设计合适的引物

3.5.2 构建沉默载体

3.5.3 构建沉默菌株

4.可行性分析

实验室具备本实验所需的仪器，比如：PCR仪、离心机、分光光度计、电泳等，以及各种所需试剂都具备齐全。另外，本实验涉及的很重要的QRT技术，实验室的师兄师姐们有人做过，所以有问题可以随时询问，这样又使实验的可行性增加了。