一个新型5-羟基吡啶-2-羧酸氧化脱羧酶的酶学特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

5-羟基吡啶酸(5hpa)是一种天然的吡啶衍生物，在环境中被微生物降解。

然而，5hpa代谢的生理、生化和遗传基础尚不清楚。

hpam是一种单组分fad依赖的单氧酶，负责5hpa到2,5-二羟基吡啶(2,5- dhp)的初始2-脱羧化羟基化。

2. 研究的基本内容和问题

目标：研究菌株PY11中HpaM单加氧酶降解5HPA的酶学特性，包括Km，Kcat值，Vmax等酶的特征参数，研究HpaM对类似结构的吡啶类物质的底物特异性内容：目标蛋白的生物信息学分析，目标基因的克隆与表达，蛋白异源表达与纯化酶学特性测定，底物特异性测定等拟解决的关键问题：酶学特性测定与分析

3. 研究的方法与方案

1.理论支撑已有研究从土壤，化工工业废水，红树林底泥，海洋，河湖，废水处理厂中分离到可以用来构建工程菌的降解菌，并研究了相关吡啶类有机污染物及其异构体的生物降解特性。

在已有研究的基础上，改善实验设计，优化培养条件，筛选更加高效、耗时短的降解菌株及降解途径。

2.实验条件可行性分析实验中心及微生物重点实验室具备如高速冷冻离心机(hitachi)、pcr自动扩增仪(mjptc200)、电转化仪(biorad)、变性梯度凝胶电泳(dcode dgge)、real-time检测系统（myiq）、-70℃低温冰箱、显微镜、细胞压力破碎仪（franch pressure）、电泳仪、自动灭菌装置、凝胶成像系统、高效液相色谱仪（waters）、气相色谱（shimadzu）、紫外-可见扫描仪（shimadzu）等实验过程中可能用到的仪器，可以满足实验要求。

4. 研究创新点

PY11中HpaM单加氧酶与已经报道的降解5HPA的单加氧酶相似度非常低，猜测具有与其他降解5HPA的单加氧酶具有不同的性质

5. 研究计划与进展

2016年9月-2016年10月：查阅各种相关文献，设计实验方案，进行预备实验，基因比对，寻找基因；2016年11月～2016年12月：预测基因活性验证及基因功能预测；2017年1月～2017年3月：降解基因的克隆及能验证；2017年4月～2017年7月：降解基因的酶学特性研究；2017年8月～2017年12月：各功能基因敲除；2018年1月～2018年3月：代谢途径分析；2018年3月～2018年5月：整理实验数据，撰写论文，准备论文答辩。