BhbR介导还原脱卤酶基因簇bhbA2B2的转录调控机制开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

项目的立项依据转录调控是细菌适应性进化的一种智慧的体现，是细菌适应环境变化而采用的一种最直接、最经济有效的方式[1]。

为了适应复杂多变的环境，细菌必须携带尽可能多的功能基因。

矛盾的是，当这些基因对当前环境压力不能发挥作用的时候，就会成为宿主的负担，不利于宿主保持竞争优势[2, 3]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标本项目以溴苯腈降解菌株comamonas sp.7d-2中卤代芳烃代谢质粒pbhb上发现的转录调控因子bhbr为研究对象，通过鉴定其转录调控单元、效应物种类和浓度、启动子结合位点和基序、调控还原脱卤酶基因簇bhba2b2转录的生理意义等方面阐明bhbr对还原脱卤酶基因簇bhba2b2的转录调控机制以及菌株comamonas sp.7d-2适应卤代芳烃毒性环境的应答机制。

研究内容 鉴定bhbr调控的转录单元鉴定，考察bhbr的效应物及其浓度、环境盐浓度、温度等对转录调控的影响，研究bhbr与启动子的结合位点与作用机制、调控元件的结合动力学等，最终阐明调控因子bhbr在响应不同环境条件下对还原脱卤酶基因簇bhba2b2的转录调控机制。

拟解决的关键科学问题阐明bhbr对还原脱卤酶基因簇bhba2b2的转录调控机制。

3. 研究的方法与方案

本项目拟采用的有关研究方法（1）转录单元鉴定 使用细菌rna提取试剂盒（tiangen）提取3,5-二溴-4-羟基苯甲酸诱导培养后的菌株comamonas sp. 7d-2的总rna，并用dnaeraser（takara）去除残留的基因组dna。

以上述rna为模板进行反转录pcr获得cdna，再以cdna为模板，通过pcr扩增基因簇中所有相邻的两个基因组成的片段来判断相邻的两个基因是否共转录，从而确定转录单元。

采用5-端快速扩增技术（5-rapid amplification of cdna ends, 5-race）确定转录起始位点。

4. 研究创新点

国内外关于细菌对卤代芳烃还原脱卤的代谢调控研究很少，其分子机制有待进一步阐明。

本项目将从分子水平阐明BhbR对还原脱卤酶基因簇bhbA2B2的转录调控机制，揭示菌株Comamonas sp.7D-2适应卤代芳烃毒性环境的应答机制。

5. 研究计划与进展

申请者所在单位南京农业大学是211工程全国重点大学，所在微生物学科为农业部和江苏省重点学科，实验室为农业部农业环境微生物重点实验室，建有400余m2的农药微生物降解的研究与应用实验室，在种质资源筛选、代谢途径鉴定、降解基因克隆、酶学特性、分子生态学等方面已建立起比较完善的研究平台并积累了丰富的经验。

申请者所在实验室拥有荧光定量pcr仪(abi)、常规pcr仪(bio-rad)、高效液相色谱仪(thermo)、气相色谱仪(thermo)、液质联用仪(thermo)、紫外-可见光扫描仪(岛津)、akta蛋白质纯化系统(ge)、电转化仪(bio-rad)、酶标仪(tecan)、细胞超声破碎仪(thermo)、高速大容量冷冻离心机(beckman coulter)，超速离心机(beckman coulter)、激光共聚焦显微镜(zeiss)、荧光显微镜(zeiss)、凝胶成像系统(bio-rad)、自动灭菌装置、核酸电泳仪、蛋白质电泳仪等，仪器设备先进齐全。

南京农业大学生命科学实验中心和作物遗传与种质创新国家重点实验室具有一流的设备条件，本实验室无法解决的条件可以借助加以解决。