ABI4表达载体的构建和原核表达开题报告

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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题的意义植物转录因子abscisic acid-insensitive 4 (ABI4)是在研究ABA信号转导途径中被发现的，在植物的生长发育过程以及在植物对非生物胁迫应答过程中发挥重要作用[1]。1994年Finkelstein筛选获得abi4-1突变体，其种子萌发、幼苗生长对高浓度的ABA不敏感，突变体种子的休眠降低，突变体中ABA响应基因和LEA相关基因的表达下降，证明了ABI4在调控ABA信号中发挥关键作用，参与了调控植物种子萌发的过程[2]。表达载体是指具有宿主细胞基因表达所需的调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录与翻译的载体。克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增，通常带有一个松弛型复制子，一个多克隆位点和一个筛选标记。而表达载体不仅使外源基因扩增，还要使其表达。一个典型的大肠杆菌表达型质粒载体除了要具有克隆载体的特点外，还需要有一个强启动子及操纵基因位点序列、转录起始信号、转录终止信号、核糖体结合位点、翻译起始密码子和终止密码子等一系列调控序列。常用的pET系列质粒在大肠杆菌中进行基因的表达受T7 RNA聚合酶的控制。pET-28大小为5369bp，具有Kan抗性。ABI4在种子萌发与休眠、胚的后期发育、幼苗生长、侧根的发育、植物开花、果实成熟、植物耐盐耐旱胁迫等方面都有重要的作用。它逐渐被认为是具有多重功能的核心调节蛋白，参与植物生长发育和植物逆境应答的多个过程[3]。构建ABI4表达载体并成功表达，将其运用到之后的科研工作中，为研究ABI4参与信号转导中一些重要的分子机制以及ABI4与其他蛋白的互作关系做出贡献，帮助我们更好地认识ABI4的生物学功能。2.国内外研究概况ABI4在植物的多个组织部位均有表达，但其表达的量不同。ABI4基因在发育的种子中表达较高，在幼苗期的子叶、下胚轴和根部也能检测到有表达，还有学者在花粉、叶片维管组织和韧皮部中也检测到ABI4基因的表达[4-8]。种子休眠可以防止或者延迟成熟种子萌发，植物内源激素脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）是调节种子从休眠向萌发转变的主要因素，二者之间具有拮抗作用。ABI4通过调控ABA和GA代谢来调节种子萌发与休眠[9-10]。植物生长和适应环境的关键步骤是侧根的形成和发育，植物侧根发育受生长素、细胞分裂素（CTK）和脱落酸的调节，其中，生长素是调控侧根发育的最主要的激素。ABA和CTK通过影响ABI4基因的表达，使ABI4的表达增强，ABI4抑制生长素运输载体PIN蛋白的表达，影响了生长素的极性分布，从而抑制侧根发育[11-14]。ABI4和ABI5可以直接结合MAPKKK18的启动子区域从而作为其上游的转录激活因子发挥功能，拟南芥的MAPKKK18 基因及其介导的 MAPK 级联途径在耐盐应答过程中发挥重要调节作用[15]，所以ABI4可以通过与MAPKKK18作用而介导植物的耐盐应答。果实成熟是大量基因表达调控相互作用的结果。近年来，随着基因组学、蛋白组学等的发展，从越来越多的植物果实中分离和鉴定出与果实成熟和衰老相关的转录因子。在番茄果实中，AP2转录因子在绿色果实、转色期果实、红色果实中均有表达，在转色期果实中表达量最高，表明AP2与果实发育有关。拟南芥中ABI4转录因子属于AP2家族，利用基因同源克隆技术获得了草莓转录因子FaABI4编码基因，研究发现，FaABI4正向调控草莓果实发育，ABI4转录因子在调控过程中是逐渐增加的，到果实成熟时，表达量达到最高[16-17]。3.应用前景植物ABI4转录因子在植物生长发育过程以及抗非生物胁迫过程发挥重要作用，随着科学研究的深入，我们对其有了一定的了解，但是仍然还有许多重要的机制值得我们去探究。ABI4参与调节果实发育具体的分子机制是什么，ABI4与其他蛋白之间具体的互作关系是什么，ABI4与一氧化氮、一氧化碳等信号分子的相互作用机制的研究，这些都需要进一步研究完善。同时，利用abi4基因构建表达载体，利用基因工程技术改变植物的基因从而使其表达更优良的性状也是研究的终点之一。参考文献：[1]Finkelstein R R. MUTATIONS AT 2 NEW ARABIDOPSIS ABA RESPONSE LOCI ARE SIMILAR TO THE ABI3 MUTATIONS[J]. Plant J, 1994, 5(6):765-771.[2]Finkelstein R R.,Wang,M.L.,et al. The Arabidopsis abscisic acid response locus ABI4 encodes an APETALA 2 domain protein.[J]. Plant Cell, 1998, 10:1043-1054.[3]段星亮. 血红素加氧酶-1和ABI4介导拟南芥耐盐和干旱胁迫的分子机理[D]; 南京农业大学, 2016.

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2. 研究的基本内容和问题

1.研究的目标、内容利用基因工程技术,构建abi4表达载体并诱导其原核表达。

成功构建abi4表达载体，为今后研究abi4参与信号转导中一些重要的分子机制以及abi4与其他蛋白的互作关系做出贡献，帮助我们更好地认识abi4的生物学功能。

2.拟解决的关键问题成功构建abi4表达载体并诱导其成功表达

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

首先将目的基因进行pcr扩增并进行纯化，之后测浓度，备用。提取pet-28a质粒，选取合适的限制性内切酶进行酶切，纯化并测量浓度。利用t4连接酶将目的基因和质粒进行体外连接，构建新的重组dna分子。把体外重组的dna引入宿主细胞，使其具有新的遗传性状，通过筛选分析，鉴定出具有所需重组dna分子的阳性克隆。选择合适的宿主菌，诱导外源基因在宿主菌中高效表达，以提高蛋白质的产量和质量。利用sds-page电泳技术检测表达蛋白质。

2.技术路线

4. 研究创新点

本实验尝试构建ABI4表达载体，为更好的对ABI4转录因子进行研究奠定基础。

5. 研究计划与进展

1、研究计划1) 2018.10-2018.11 查阅资料，整理实验思路，学习基本方法2) 2018.11-2018.12 学习基本实验操作，熟悉各步骤流程，能够了解其中各步骤的原理3) 2019.02-2019.03 能够独立的构建载体并完成其原核表达，解决实验中遇到的问题4) 2019.03-2016.04 分析实验结果，撰写毕业论文。

2、预期进展1) 成功构建abi4表达载体。

2）成功表达。