2.福建侧褶蛙微卫星引物的筛选及扩增开题报告

1. 研究目的与意义

福建侧褶蛙（pelophylax fukienensis）分布在江西、福建、台湾等省。该蛙的系统学地位至今未得到共识，且未在分子水平做过种间或种下的研究。

分类学的争议表明，福建侧褶蛙是具有高度遗传多样性的蛙类，有必要采用分子系统学和生物地理学的方法，揭示种或亚种内和种或亚种间的线粒体和核dna的多样性，阐明种或亚种间的进化关系，探讨物种形成和种群分化过程中的一些理论问题。

微卫星(microsatellite，ms) 是指核基因组中小于10 个核苷酸的简单重复序列，又称短串联重复(short tandem repeat，str) ，是一种普遍存在于人类及其他动物基因组的重复序列，一般为2～6 个碱基重复，如 (ca)n、( gt)n、(gga)n 、(cag)n 等，尤以 (ca)n 重复序列最为常见。微卫星dna主要由核心序列和侧翼序列组成，其长度由重复单位的拷贝数决定。

2. 国内外研究现状分析

在两栖类种下水平的研究中，使用的分子标记有aflp、microsatellite、intron和 mtdna等（vallender et al.，2007；rabosky al.，2009）。由于线粒体基因的进化速度较快，可以显示近缘种间和种内各种群间的差异，因此它们较多的用于动物种内及近缘种研究，常用的标记有cyt b、co1、nd1、nd3、12s rrna、16s rrna、trna等。由于线粒体基因组控制区（d-loop）的进化特别快，也被应用于许多物种的种下研究。但是，由于mtdna具母系遗传的特性，雄性个体不能把线粒体基因组传递给下一代，用mtdna标记只能检测到雌性种群的结构、迁移及基因流，无法检测到不同种群之间雄性个体的迁移和基因流。只有把mtdna标记和ncdna标记组合使用，才能对种群结构、迁移和基因流等进行客观的分析（leach et al.，2006；vallender et al.，2007；yuri et al.，2009）。由于微卫星标记遍布整个基因组，具有多态性高、共显性遗传、选择中性、容易被pcr 扩增、易于检测、重复性好等特点，已经被应用于动物种群遗传学及种间基因渐渗研究（pastorini et al.，2009）。

微卫星标记因其丰富的多态性和共显性等特点，已得到了广泛的应用。应用微卫星标记首先需要获得微卫星位点的序列信息，用来设计引物。

最简便、最省时的方法是从公共数据库（如embl、genbank、est 数据库等）或已发表的文献中查找到微卫星位点，但只限于已经有序列数据发布的物种。还有一种方法是种间转移扩增，即从相近物种的数据库中查找微卫星位点，或使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。

3. 研究的基本内容与计划

研究内容：

（1）提取采自台湾、福建、江西3省14个样地的福建侧褶蛙标本模板：采用sds/蛋白酶k裂解，传统酚-氯仿法提取基因组dna （sambrook et al.，2001）。

（2）微卫星位点的筛选：根据已有的金线侧褶蛙文库中含有重复单位的序列，利用这些序列设计引物，得到能稳定扩增的多态性位点。

4. 研究创新点

本研究首次筛选合适的微卫星引物，对分布于台湾、福建及江西等地的福建侧褶蛙种群微卫星进行扩增，为研究福建侧褶蛙种群遗传结构及系统地理学打下基础。