杨树rRNA基因的获得与染色体定位分析开题报告

1. 研究目的与意义

美洲黑杨树是中国林科院运用现代生物技术培育的杂种无性系树种，被誉为目前世界上生长最快的杨树。其具有抗寒，喜光，不耐盐碱，不耐干旱，在冲积沙质土上生长良好等一系列的优良特质。近年来，对于荧光原位杂交技术的应用越来越广泛，只要两个核酸分子碱基序列互补,就可在适宜条件下形成稳定的杂交分子,FISH就是利用这一原理将标记探针同组织、细胞核或染色体DNA进行杂交,经荧光检测体系对待测核酸定性、定位或相对定量分析的一种研究方法。而将FISH技术运用于黑杨进行杨树rRNA基因的获得与染色体定位分析，为美洲黑杨的遗传多样性研究提供了良好的基础。

2. 国内外研究现状分析

对于杨树染色体方面的研究，现多采用RNA原位杂交技术来对植物基因表达进行研究，原位杂交技术是从Southern和Northern杂交技术衍生而来的,可以分为染色体原位杂交和RNA原位杂交。染色体原位杂交是用标记的DNA或寡核苷酸等探针来确定目标基因在染色体上的位置。RNA原位杂交是用同位素(如³H、³⁵S和³²P等)或非同位素〔如地高辛(DIG)和生物素(BIO)等〕标记的双链DNA或单链反义RNA探针,对组织切片或装片的不同细胞中基因表达产物mRNA(或rRNA^〔23〕)进行原位定位。分布于细胞中的mRNA与反义RNA探针互补而杂交产生双链的RNA。标记在反义链上的同位素经放射自显影;非同位素经酶促免疫显色或免疫荧光反应而显示mRNA在植物组织细胞中的分布位置。用标记的有义RNA作探针,因与细胞内的mRNA不互补而不能杂交,可以作为对照。杨树生长发育过程中的基因表达有时空顺序差异。特异表达基因的转录产物mRNA,会在植物器官的特定发育时期和特定组织中检测到;而非特异表达的mRNA也会在不同发育阶段和不同组织中检测到。植物基因表达调控的研究,对于深入探讨植物细胞代谢、分裂、分化机制,有效控制植物生长发育的生命过程有着十分重要的意义。RNA原位杂交能够确定细胞甚至亚细胞水平的基因表达的时空特征,对于植物生长代谢、成花过程育性转换、受精与胚胎发生等生命活动中的基因表达调控机制提供直接的资料。原位杂交技术还会与其它分子生物学技术、显微操作技术、免疫学技术等结合,深入研究基因的结构、功能和表达的调控机制。发育调控基因的分离与功能分析可能会成为最热门的课题。在这方面,国内工作起步较迟,需要进一步加以应用。

3. 研究的基本内容与计划

利用随机引物法，以美洲黑杨基因组dna为模板对5s和18s rrna进行扩增，并标记为探针后，与杨树中期染色体进行杂交。在对相应序列进行染色体定位的基础上，获得某些染色体的特异标记。使用fish技术来进行杨树rrna基因的获得与染色体定位分析。最后采用三线表得出相应结论。

随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的dna片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到dna合成引物的作用。将这些引物与变性的dna单链结合后，以4种dntp（其中一种是标记物标记的dntp）为底物，合成与探针dna互补的且带有标记物的dna探针。

荧光原位杂交( fluorescence in situ hybridization,fish)技术是20世纪80年代末在已有放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传学技术,具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点。目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增,产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域。该技术的原理为：只要两个核酸分子碱基序列互补,就可在适宜条件下形成稳定的杂交分子,fish就是利用这一原理将标记探针同组织、细胞核或染色体dna进行杂交,经荧光检测体系对待测核酸定性、定位或相对定量分析的一种研究方法。其基本操作步骤可概括为制备染色体、标记探针、将探针与实验材料靶序列杂交以及检测杂交结果.

4. 研究创新点

在杨树分子细胞生物学研究中，目前急需将分子生物学数据与细胞学数据相结合，找到可以对每条染色体进行标记的marker，为杨树每条染色体构建起细胞遗传图谱的框架，这将会为后期高密度遗传图谱，物理图谱的构建奠定良好的基础。

利用随机引物法，以美洲黑杨基因组DNA为模板对5S和18S rRNA进行扩增，并标记为探针后，与杨树中期染色体进行杂交。在对相应序列进行染色体定位的基础上，获得某些染色体的特异标记。使用FISH技术来进行杨树rRNA基因的获得与染色体定位分析。最后采用三线表得出相应结论。