利用CODEHOP设计兼并引物PCR扩增杉木种子14-3-3蛋白质基因片段开题报告

1. 研究目的与意义

由于不同的14-3-3蛋白同工型在植物不同组织中表达,并且差异很大,它们特异性地调控靶蛋白,参与植物细胞内一系列信号转导和代谢过程,影响植物的生长发育。本课题旨在利用CODEHOP设计兼并引物PCR扩增杉木种子14-3-3蛋白质基因。

14-3-3蛋白质在植物生长发育中起了重要的调控作用，目前已知有300多种靶蛋白可以与14-3-3蛋白相互作用，主要体现在参与多种植物激素信号通路，参与植物体内物质运输的通道，参与植物营养代谢的调控，参与植物光信号通路以及植物细胞周期的调控[3]。利用CODEHOP设计兼并引物PCR扩增杉木种子14-3-3蛋白质基因，将为后续的大规模生产14-3-3蛋白质打下基础，对于我们研究14-3-3蛋白质，了解其特定的功能以及与靶蛋白相互作用的机制有着极大的帮助。

2. 国内外研究现状分析

自1998年美国癌症治疗中心设计CODEHOP程序并公布于互联网以来，许多有关未知病毒、细菌及基因家族新成员的研究工作得以开展，并取得成功[1]。相较于传统的运用常规引物来扩增目的基因的方法，利用CODEHOP设计兼并引物PCR扩增目的基因则具有很多优越性。传统的方法有效引物利用率低，不利于扩增。，与传统引物相比，CODEHOP引物则由两部分组成，包括短的3简并核心区域引物和长的5非简并夹板区。利用CODEHOPsPCR方法设计的引物每条引物在3简并核心区域都包含不同的序列，而5非简并夹板区则是均匀的序列。这种方法可以并克服兼并引物和通用引物设计的内在缺陷，具有更高的特异性和灵敏度。这种方法目前已经广泛的应用于目的基因的扩增。

自从14-3-3蛋白由Moor和Perez(1967)首先在牛脑组织细胞中发现[2]，人们对其的研究就一直没有停止过。14-3-3蛋白在植物的发育过程中起着重要的调控作用，它是一类高度保守并且在真核生物中普遍存在的调控蛋白，其独特的分子结构决定了它的主要功能：参与蛋白质与蛋白质的相互作用，包括刺激或抑制酶的活性、作为蛋白与蛋白之间的桥梁、调节蛋白在细胞中的位置等。目前，在14-3-3蛋白的研究上已经取得了很大的进展，但是在14-3-3蛋白与其他蛋白的相互作用以及机制上仍然存在很多问题没有得到有效的解决。

3. 研究的基本内容与计划

1.实验材料

1.1主要数据库与软件

blastp(ncbi，usa)；blockmaker(fredhutchinsoncancerresearchcenter，usa)；codehop(fredhutchinsoncancerresearchcenter，usa)blastx(ncbi，usa)．

4. 研究创新点

Codehop方法的原理是设计的简并引物包括两个部分，一部分利用序列比对中得到的保守区内连续保守的3-4个氨基酸序列（9-12个碱基）设计得到3简并核心区；另一部分是根据根据保守氨基酸和密码子偏好性原则预测得到最佳配对的5非简并夹板区。设计过程中利用减小3简并核心区的长度可以减少简并引物中简并碱基的使用量，扩增过程中，5非简并夹板区可以很好的稳定3简并核心区与模板的结合，从而很大程度上提高了扩增的特异性，而且利用加长5非简并夹板区序列可以提高引物退火温度同时不增加简并度。尽管初轮扩增中5特异区可能与模板序列发生错配，但是3核心区的不匹配会使引物在延伸过程中失效，几轮扩增后引物特异性匹配会大幅增加，以此提高特异性和准确率。