农杆菌介导转化杨盘二孢菌原生质体体系的构建及优化开题报告

1. 研究目的与意义

杨树（popular）是林木中的模式树种，也是重要的速生用材树种，具有重要的经济价值。

杨树在生长发育过程中会受到多种病虫害的危害。

杨树黑斑病是杨树的一种重要病害，其致病菌是一种真菌杨生褐盘二孢菌。

2. 国内外研究现状分析

丝状真菌作为低等的真核生物，对人类生命活动的各个方面均产生了深远的影响。

目前，国内外对类似于杨生褐盘二孢菌的真菌的研究较为广泛，尤其是这些真菌对果树、农作物等造成的威胁，迫使科学家们加快认识这类病害危害严重的分子机理，为实现病害的可持续控制指明方向。

例如，贾娜娜、翟立峰研究者等发现梨腐烂病是我国西北、东北和华北梨产区的重要病害，其病原菌是v. pyri。

3. 研究的基本内容与计划

本研究以杨生褐盘二孢菌强致病力菌株214-1作为出发菌株，利用以潮霉素和绿色荧光蛋白基因为标记基因的敲除载体pcambia1300，采用atmt技术进行遗传转化。

摸索优化农杆菌浓度、农杆菌与分生孢子的混合比例、共培养时间等遗传转化条件，建立稳定且高效的根癌农杆菌介导的杨盘二孢菌遗传转化体系。

随机选择30个转化子，采用潮霉素特异性引物进行验证，扩增出1300 bp条带，证明t-dna已稳定插入基因组。

4. 研究创新点

基因敲除（gene knockout）又称基因打靶（gene targeting），是对序列已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除或用其它顺序相近的基因取代，根据宿主的形态、生理生化特性等的变化来推测相应基因的功能。

目前已有多种真菌构建了含丰富类型转化子的突变体库，并已由在酵母和哺乳动物中的应用，拓展到了植物、真菌基因功能研究中，包括敲除载体构建、敲除载体的真菌转化、转化子筛选和目的敲除转化子鉴定等[11]。

但是，由于t-dna本身的性质，它会随机的插人到基因组的任何一个位点中，而且t-dna随机插人的概率要远远高于同源重组的概率，所以，通常要筛选大批量的转化子才能得到基因敲除的转化子[12]。