杨树杨盘二孢菌沉默抑制子的筛选开题报告

1. 研究目的与意义

在世界范围内，植物病害几乎威胁着所有的作物和林木，有些甚至间接危害着人类的生存，严重影响粮食的产量，带来了巨大的经济损失并且造成严重的生态破坏，如水稻稻瘟病^[1]、小麦赤霉病^[2]等最常见的粮食作物毁灭性病害。植物病理学家一直尝试去了解病原菌侵染植物的机制从而寻找到防治病害的方法。进入21世纪以来，随着植物分子免疫理论的进一步发展，人们发现效应因子（effector）是病原菌侵染植物并建立定殖的关键因素，因此围绕着效应因子开展了一系列的研究。

据相关研究发现，效应因子与植物免疫中的rna沉默（rna silencing）有重要关联。rna沉默是植物抵御病原菌侵染的重要机制,具有基因调控、防御外源核苷酸入侵的功能^[3]。入侵宿主后，病原菌会编码rna沉默抑制子来限制宿主的rna沉默，从而达到进一步侵染宿主的目的^[4]。由于效应因子在植物免疫方面的重要作用，它已成为了植物病理学研究的重要内容。目前已证明了病毒、细菌和卵菌^[5]普遍通过效应因子作为rna沉默抑制子，操纵宿主rna沉默以实现成功定殖。有些病毒沉默抑制子已被开发应用于植物生物反应器、抗病毒植物等领域。然而，在真菌效应因子的功能和作用机制研究相对滞后的背景下，人们还未取得真菌效应因子作用于宿主rna沉默的直接例证。

本课题小组选定杨树黑斑病的一种病原真菌杨生褐盘二孢菌（marrssonina brunnea）作为研究对象。杨树感染黑斑病后，表面和背面以及幼嫩的叶柄、茎段上会出现黑色斑点，叶片会过早脱落，植株光合作用效率下降，严重发病时影响树木生长，也可导致实生苗枯死，从而使得经济效益明显下降^[6]。杨生褐盘二孢菌和杨树的基因组序列已被全部测出，而且杨生褐盘二孢菌是一种半活体营养型病原真菌，易于培养和遗传转化，因此被选为作为研究对象。本课题小组希望可以通过杨生褐盘二孢菌和杨树之间的免疫机制发现突破口，找到真菌效应因子的直接例证，从而更好地在分子水平上研究宿主和病原菌的相互关系，加强植物病害的防治工作。

2. 国内外研究现状分析

在进化过程中，植物为了应对病原菌的侵染，进化出了rna沉默这一防御机制，然而，许多植物病原菌与植物之间产生了协同进化，病原菌入侵植物后会表达产生效应因子，效应因子是一种可以分散到植物细胞中并与相应受体相互作用的分泌蛋白，从而干扰植物的免疫系统^[7]，加大侵染程度。除了植物，在自然界中，真菌、无脊椎动物等也都拥有rna沉默机制，对应的病原菌也会产生特异的rna沉默抑制子。由此，效应因子成为了病原菌侵染机制的研究重点。

目前，国内外的研究已经让我们对rna沉默机制以及效应因子有了更深入的了解。rna沉默机制会表达产生多种核心蛋白，由于物种间的差异性，核心蛋白在种类和数量上存在特异性，另外发现有些rna沉默在进化过程中退化消失，会由其他的系统代替。并且，rna沉默机制也存在靶向特异性，会与入侵病原菌的rna相互作用^[7]。同时研究也发现，在转基因拟南芥中，效应因子与作用基因之间也存在着靶向性，它会干扰靶基因的正常表达，严重时会导致宿主出现一系列的发育缺陷^[8]。另外，许多研究人员以生活中常见的植物病害作为出发点，主要研究受侵染植物和病原菌在免疫上的相互机制，探索rna沉默和效应因子之间的关系。水稻是重要的粮食作物，受到病菌侵染后产量会下降，直接影响人类的生活，现在研究人员重点研究了水稻病原菌中的稻曲菌^[9]和稻瘟菌^[1],并且从这两种病原菌提取筛选了潜在的rna沉默抑制子，以期望更好地深入了解水稻rna沉默机制与病原菌效应因子之间的关系，有助于针对水稻病害做出更好地预防措施。在大豆病害方面，研究人员成功筛选到了大豆疫霉菌的两个效应因子能够作为rna沉默抑制子，促进疫霉菌在大豆内的成功侵染^[10,11]。在黄瓜花叶病毒中，研究人员发现病原菌编码的2b蛋白是必不可少的，该蛋白可抑制黄瓜rna沉默，并有定位作用^[12]。本次课题选用的是杨树和杨生褐盘二孢菌互作体系，前期研究人员已经从杨生褐盘二孢菌中筛选到了一些潜在的效应因子^[13]，这也可以有助于本次课题的成功开展。

在验证效应因子是否可作为植物rna沉默子时，研究人员采用农杆菌共浸润抑制分析法^[14]，通过在16c转gfp基因烟草叶片中共注射携带效应因子和外源gfp的农杆菌，从而筛选得到潜在的沉默抑制子。利用这种方法，研究人员已经鉴定出了数十种植物病毒中的沉默抑制子^[15]。

3. 研究的基本内容与计划

3.1研究内容

本研究拟通过农杆菌共浸润抑制分析法高通量筛选igy效应因子，鉴定出具有抑制rna沉默功能的效应因子，这些结果为我们研究真菌效应因子的功能及具体作用机制提供了突破口，同时也是真菌效应因子可作为rna沉默抑制子的首例，进而说明抑制rna沉默是自然界病原物普遍采用的反防御策略。

3.2研究计划

4. 研究创新点

（1）在杨树等林木树种进行分子免疫研究尚属首次。有关植物-病原微生物相互作用的研究目前已经很多，但主要集中在拟南芥、水稻和番茄等草本模式植物及其病原菌上，针对木本植物尤其是林木的植物分子免疫相关研究鲜见报道。我们以杨树和杨生褐盘二孢菌作为材料进行林木抗病方面的研究，可以为林木抗病育种研究提供理论基础。

（2）目前研究杨树-杨生褐盘二孢菌多以高通量测序为手段，虽获得大量的基因组、转录组及蛋白质组数据，但均不深入，对具体基因功能、效应因子在杨树-杨生褐盘二孢菌互作中的作用鲜少涉及。本项目率先对杨生褐盘二孢菌效应因子进行机理研究，有望对杨树-杨生褐盘二孢菌互作机制及其调控有更深入的认识，在指导杨树抗性育种和转基因工程中有较强的实践意义。

（3）立意新，目前已在病毒、细菌、卵菌中发现rna沉默抑制子，然而，真菌作为自然界病原微生物的主要类群之一，是否也进化出同样的反防御策略来抑制寄主rna沉默呢？目前，国内外还未曾报道，而此方面的研究将进一步说明抑制rna沉默是病原微生物所普遍采取的反防御策略，对分子免疫理论方面将是一个突破性的认识，这也是本项目的特色与创新之处。