超螺旋DNA构型调控机制研究开题报告

1. 研究目的与意义

一般来讲，将超螺旋引入dna分子有两种方法：一是利用拓扑异构酶直接引入；二是利用一定浓度的dna嵌入剂（dna intercalator）结合拓扑异构酶间接引入。然而两种方法都有其局限性。采用拓扑异构酶直接引入的方法一般只能将一定程度的超螺旋引入dna分子；而dna嵌入剂的方法虽然可以引入不同程度的超螺旋，但得到的dna分子无法直接确定其超螺旋密度，需根据嵌入剂浓度的经验值粗略估算，或通过其他较为繁琐的方法间接测定。此外，该方法很难得到超螺旋密度较低的dna分子。

生物体内的拓扑异构酶作用于dna分子改变其超螺旋状态，本质来讲是改变了底物cccdna的双链连接数（lk）。pna是一类和dna具有相似构型的小分子聚合物。pna的主链骨架是由n-(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成。由于骨架的电中性，pna很容易特异性地与互补的dna分子杂交，形成稳定的复合体。我们利用pna的这一性质，将含有特定结合位点的dna与一定长度的pna分子相结合，从而达到可控的改变dna双链连接数（lk）的目的，最终得到特定超螺旋密度及符号的dna分子。

dna分子在体内几乎都以超螺旋状态存在，本研究将探讨超螺旋结构的体外调控机制，为研究超螺旋dna形成机制以及相关靶向药物设计奠定必要的理论及实验基础。

2. 国内外研究现状分析

在2015年十月nature上报道，美国贝勒医学院的研究人员，使用一种多学科的方法，以前所未有的细节，揭示了超螺旋DNA的三维结构影像图，从而发现它的形状比著名的双螺旋更加动态。

国内主要通过凝胶电泳和原子力显微镜观察。

3. 研究的基本内容与计划

研究内容：

(1)从模板质粒中扩增目标序列，构建小型环状dna分子；（2）研究pna分子入侵双链dna机制；(3) 通过原子力显微镜观察调控得到的超螺旋分子的结构特征。

开题时间：为2016-2017学年第二学期的第1-2周。

4. 研究创新点

要通过PNA入侵的方法改变DNA的双链连接数（Lk），被入侵的DNA分子需处于非共价闭合环状态。

我们需先将一个nicking位点引入先前构建的含有G4序列的cccDNA，使其双链DNA中的一条被切断，即处于非完全闭合环状态。