拟南芥DES1基因的克隆与酵母双杂载体构建开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 本课题研究意义 1．1 扩充des1在调控机理和信号通路方面的研究在拟南芥中des1是唯一一个被鉴定出位于细胞质的l型半胱氨酸脱巯基酶(l-cysteine desulfhydrase, lcd)[1]。

在植物体内，h2s可以通过半胱氨酸脱巯基酶分解出h2s、丙酮酸盐和nh3。

研究des1相关蛋白与des1的互作可以深入了解des1在该反应中是如何被调控的。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标利用酵母双杂交技术筛选与des1互作的蛋白，以期扩充des1在调控机理和信号通路方面的研究。

2 研究内容利用pgbkt7质粒构建拟南芥des1表达载体，并与cdna文库载体共转化至酵母感受态中，通过抗性和报道基因结果在cdna文库中筛选与des1有相互作用的蛋白，通过测序确定其编码基因序列，进而发现新基因。

3 拟解决的问题 des1是半胱氨酸分解为硫化氢的关键酶，而关于des1酶活的调控研究仍不完善，本课题期望利用酵母双杂交技术筛选出与des1互作的蛋白，继而研究这些蛋白因子是如何对des1进行作用和调控的，以及其对des1的酶活起正调控还是负调控作用，具有重要意义。

3. 研究的方法与方案

1 研究方法 trizol法提取叶片总rna；反转录酶合成cdna；pcr克隆des1并构建重组载体；酵母感受态的制备；热激共转化法转化酵母感受态；酵母双杂交筛选。

2 技术路线提取总rna并合成cdna;设计des1引物；克隆des1并构建pgbkt7-des1表达载体；构建cdna文库表达载体；热激共转化入酵母感受态细胞；根据报道基因和筛选培养基获取目的菌落；提取质粒后测序分析。

3 实验方案 3.1 rna的提取提取rna所用的离心管、枪头及无菌水等均经过0.2焦碳酸二乙酯过夜处理，高压蒸汽灭菌（121℃, 20 min），烘干备用。

4. 研究创新点

关于DES1的研究近些年才逐渐增多，所以对于DES1在调控网络中与其他因子的互作并没有十分完善。

本课题期望能够发现新的与DES1互作的相关因子从而提供该研究领域的新进展和新内容。

5. 研究计划与进展

2016.12至2017.01克隆DES1；构建载体；提取总RNA并合成cDNA 2017.02至2017.03制备酵母感受态并转化DES1表达质粒和cDNA文库质粒 2017.04至2015.05涂布筛选得到目的菌落，提取质粒后送公司测序分析