菜豆根瘤菌CFN42中影响其接受共生岛的基因筛选开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1本课题研究意义根瘤菌和豆科植物可形成共生固氮体系，将大气中的n2还原为植物可以利用的氮元素，与此同时豆科植物为根瘤菌提供碳源、能源以及其他营养物质。

该固氮体系所固定的氮约占全球生物固氮总量的65%。

目前我国已经发现的豆科植物约有1100中，然而可以与根瘤菌结瘤的只有极少数[1-2]。

2. 研究的基本内容和问题

在根瘤菌的研究中，发现共生岛的水平转移在某些菌株中可以发生，如s. medica usda1037等，有些菌株中不能发生，如b. japonicum usda110。

本课题利用b. japonicum作为受体菌，将其hsdr基因进行敲除后验证其是否能接受ors571中的共生岛。

本课题拟解决的问题即为研究受体菌中的限制性核酸内切酶hsdr是否为影响共生岛基因水平转移的因素。

3. 研究的方法与方案

1. 研究方法二亲接合基因敲除质粒，总dna提取聚合酶链式反应（pcr）dna的限制性酶切与酶连反应dna凝胶电泳测定共生岛水平转移频率2.技术路线b.japonicum受体菌中敲除hsdr基因→受体菌与供体菌二亲接合：(1)得到接合子→测定共生岛水平转移频率 (2)未得到接合子→hsdr对共生岛水平转移没有影响实验方案：1.常规实验方法：1.1 根瘤菌总dna的提取（1）挑取根瘤菌单菌落于ty液体培养基活化至稳定期，取2 ml菌液10000 rpm离心2min，弃去上清液；（2）用1 ml te buffer重悬菌体，10000 rpm离心2 min，弃去上清液，重复此步骤2~3次；（3）用270 μl te buffer重悬菌体，加入15 μl溶菌酶（储存于-20℃），冰浴30 min；（4）依次加入15 μl 10%的sds、10 μl蛋白酶k混合均匀后37℃水浴0.5~1 h至溶液变澄清；（5）加入200 μl 5 m nacl（储存于4℃），剧烈振荡混匀；（6）加入500 μl酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，10000 rpm离心10 min（重复此步骤2~3次，直到分界面看不到明显的白色絮状沉淀）；（7）取离心后的上清液于1.5 ml离心管中，依次加入0.8倍体积的 te buffer、等体积的异丙醇，混匀后于-70℃放置10 min；（8）10000 rpm离心10 min，弃去上清液，沉淀用75 % 的预冷乙醇洗涤三次；（9）自然吹干后的沉淀用50 μl ddh2o溶解，保存在-20℃备用。

1.2 大肠杆菌质粒的提取（1）挑取大肠杆菌单菌落于lb液体培养基活化至稳定期，取2 ml菌液10000 rpm离心2 min，弃去上清液；（2）加入100 μl溶液Ⅰ（储存于4℃）重悬菌体，冰浴10 min；（3）加入100 μl新鲜配制的溶液Ⅱ，缓慢颠倒数次至溶液变澄清，冰浴10 min；（4）加入100 μl溶液Ⅲ（储存于4℃），缓慢颠倒几次至到白色絮状沉淀产生，冰浴10 min；（5）加入1~2滴氯仿，10000 rpm离心10 min；（6）取上述离心后的上清液于1.5 ml离心管，加入200 μl 7.5 m的醋酸铵，10000 rpm离心10 min；（7）取上述离心后的上清液于1.5 ml离心管，加入1 ml无水乙醇，混匀后于-70℃放置10 min；（8）10000 rpm离心10 min，弃去上清液，沉淀用75%预冷乙醇洗涤三次；（9）自然吹干后的沉淀用50 μl ddh2o溶解，保存在-20℃备用。

1.3 大肠杆菌dh5αλpir和sm10 λpir感受态细胞的制备（1）挑取新鲜长出的大肠杆菌单菌落于lb液体培养基过夜活化；（2）按照1%的接种比例将菌液接种于200 ml无盐lb培养基中（成分基本与普通lb液体培养基相同，只是不含nacl），37℃摇床培养至od600 0.5左右；（3）将上述菌液置于冰上放置0.5~1h，同时将离心机预冷到4℃；（4）冰浴后的菌液转移至4℃预冷的500 ml离心瓶中，8000 rpm离心10 min，弃去上清液；（5）加入等体积4℃预冷的ddh2o洗涤菌体，重复此步骤2~3次；（6）加入1/5体积4℃预冷的10%的甘油洗涤菌体一遍；（7）加入1/200体积4℃预冷的10%的甘油将菌体重悬，50 μl/管分装于无菌pcr管于-70℃保存，备用。

4. 研究创新点

本实验在实验室前期实验基础上，进一步研究hsdR是否对受体菌接受共生岛的水平转移有影响。

5. 研究计划与进展

2016.3-2017.4 构建hsdR的框内敲除株B.japonicum2015.5 测定共生岛转移频率