拟南芥SEC6基因在主根细胞程序性死亡中的功能初步研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1本课题研究意义 细胞程序性死亡是指生物体生长发育过程中，由自身基因编码的、主动并有序的进程，是生物体新陈代谢过程中正常的生理反应[1] 。

或定义为，生物体内健康细胞在特定的细胞外信号的诱导下，死亡途径被激活，在有关基因的调控下发生死亡的一种细胞死亡方式。

在生物体生长发育过程中，细胞程序性死亡与细胞增殖都是非常重要和不可或缺的事件。

2. 研究的基本内容和问题

1研究目标本研究的目的在于探索sec6基因在主根细胞程序性死亡中的功能及作用机制。

2实验内容以exocyst复合体亚基sec6基因花粉回补的孢子体突变体prsec6-1以及活性氧突变体rbohd、乙烯突变体ein2-5、液泡加工酶突变体γ-vpe、水杨酸突变体npr1为材料，通过杂交方法获得prsec6-1 rbohd、prsec6-1 ein2-5、prsec6-1 vpe-1、prsec6-1 npr1双突变体，检验双突变纯合后再通过台盼蓝、dapi、dhcf-dc等染料染色，结合遗传学试验分析其主根发育表型。

3拟解决的关键问题本研究主要探索在拟南芥中sec6基因突变与细胞程序性死亡现象的关联。

3. 研究的方法与方案

1研究方法与实验方案我们拟采取分子生物学、细胞生物学、生物化学、遗传学等试验手段，来研究SEC6基因突变引起拟南芥主根细胞程序性死亡的作用机制，具体如下：（1）将花粉回补的孢子体突变体PRsec6-1分别与活性氧突变体RboHD、乙烯突变体ein2-5、液泡加工酶突变体γ-VPE、水杨酸突变体npr1杂交，获得PRsec6-1 RboHD、PRsec6-1 ein2-5、PRsec6-1 VPE-1、PRsec6-1 npr1双突变体；（2）通过PCR方法检验双突变体纯合，并获得纯合双突变体种子；（3）通过台盼蓝、DAPI、DHCF-DC 等染料染色，结合遗传学试验方法，观察并分析不同突变背景下PR6-1突变体的主根发育表型；（4）采用real-time PCR方法，观察结果并分析SEC6基因引起主根细胞发生程序性死亡的作用机制。

4. 研究创新点

本项目首次研究exocyst复合体与植物主根细胞发生程序性死亡之间的关系，对进一步研究exocyst复合体的功能有重要意义，也有利于人们进一步了解植物细胞发生程序性死亡的机制。

2技术路线i.拟南芥prsec6突变体主根细胞程序性死亡机制研究ii.不同突变背景下prsec6-1纯合突变体的构建iii.(1)细胞染料染色， 观察主根发育表型，确定不同突变背景下sec6突变对pcd的影响(2)real-time pcr确定sec6突变后各影响因子的作用顺序iv.了解sec6基因引起主根细胞发生程序性死亡的作用机制3可行性分析（1）鉴于双子叶模式植物拟南芥基因组测序工作已经完成，而且其遗传特性研究较为清楚，我们将用拟南芥为材料进行植株水平的研究。

拟南芥的大规模突变体库、cdna，基因数据库及大量的芯片数据为本研究奠定了基础（2）在本研究的前期工作中，我们已经得到了纯合的花粉回补的孢子体突变体prsec6-1、活性氧突变体rbohd、乙烯突变体ein2-5、液泡加工酶突变体γ-vpe、水杨酸突变体npr1，并通过杂交得到部分双突变体，包括prsec6-1 rbohd、prsec6-1 ein2-5、prsec6-1 vpe-1、prsec6-1 npr1，为本研究的开展奠定了材料基础。

5. 研究计划与进展

2016年9月-2016年12月（1）种植并检验花粉回补孢子体突变体PRsec6-1、活性氧突变体RboHD、乙烯突变体ein2-5、液泡加工酶突变体γ-VPE以及水杨酸突变体npr1为纯合体；（2）将上述纯合单突变体杂交得到双突变体，并验证为纯合双突变体。

2017年1月-2017年5月（1）分别通过台盼蓝染色、TUNEL试剂盒、DHCF-DC等方法检测主根细胞是否死亡、死亡方式是否属于PCD、活性氧含量有无变化等；（2）通过real-time PCR方法确定SEC6基因突变导致各影响因子表达量发生变化的先后顺序。