大豆ABC（ATP-Binding Cassette） 转运蛋白基因在脂质分泌中的功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1 越来越多的证据表明真核细胞中abc转运蛋白参与细胞膜脂类分子的转运^[1]，目前对abc转运蛋白作用机理研究基本透彻，故不再展开研究。本次研究目的在于在大豆中寻找几个可使油脂合成及转运量大大提高的基因，利用敲除同源基因的酵母和拟南芥突变体验证这些基因的基本功能。本研究可推广至农业生产，大大提高农作物种子含油量。此外，目前对abc转运蛋白参与油脂转运的研究进展很慢，这方面的进一步研究将会对人类abc转运蛋白的研究提供重要线索，并起到很大促进作用^[2]。

1.2 脂质的合成与分泌对于酵母菌的生存与进行理化反应有着非常重要的意义。首先，脂质的合成与酵母菌体内的物质运输有关，脂质合成与囊泡的合成与运输之间相互作用，能够提升酵母体内的物质运输效率。同时，脂质的合成对于酵母菌本身的保护与抵御侵害也起着重要的作用，有着非常重要的研究价值。随着生物技术的快速发展和人们对微生物油脂的深入研究，用微生物(如酵母)生产油脂为油脂资源的开发提供了一条新途径^[3]。酵母生产油脂具有油脂含量高、原料来源丰富、生产成本低、生产周期短等优点。目前，美国、德国、日本等国已有商品化的微生物油脂面市。在欧洲、中东、南亚和澳洲等地已允许将某些微生物油脂添加到婴儿食品中^[4]。因此开展酵母油脂的研究对解决人类面临的人口增长、资源短缺、环境恶化、人类健康等现实问题具有重要的意义。

1.3 脂质的合成与分泌在植物生理与生化过程中同样占有十分重要的地位。拟南芥作为理想的模式植物，与油料作物（如油菜）同属十字花科植物。本研究为油菜等油料作物的高含油量育种和转基因技术改良提供宝贵的信息和基因资源。现在已见报道的植物脂质在植物的信号转导、防御反应中具有多种功能^[5]，此外油脂合成量也是油料作物产率的决定性因素之一。因此，本项目同时可以为植物保护、农学等多学科提供相关研究基础。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

1、确认酵母中与脂质分泌有关的abc转运蛋白编码基因。

2、比较上述酵母中abc转运蛋白编码基因与植物中同源基因。

3. 研究的方法与方案

拟采取的研究方法

1、查找大豆基因

符合条件的大豆基因可能直接在文献及数据库检索有困难，故可先在酵母中寻找能够增强脂质分泌的酵母基因，再寻找同源的大豆基因。

（1）通过查阅文献筛选文献的方式在酵母中查找与油脂合成与外泌有关的基因。

（2）通过相关网站分析在大豆中找出与酵母基因同源的ABC转运蛋白基因。

2、大豆基因克隆

（1）从核酸数据库中获得上述大豆基因编码序列。

（2）从大豆中提取总RNA。

（3）逆转录获得大豆细胞的cDNA。

（4）PCR扩增目的基因（重点是PCR引物的设计）。

（5）PCR产物的琼脂糖凝胶电泳回收。

3、大豆克隆基因的表达与表达产物功能验证

I. 在酵母中基因功能验证

（1）获取缺少大豆同源基因的酵母突变体（mutant）。

（2）转化，将转化子进行表型分析及PCR鉴定。

（3）选取6-10个重组酵母菌株进行小规模蛋白质表达，测定脂质合成和分泌的量。

（4）表达量最高的重组酵母菌株进行大规模蛋白质表达，确认同源基因的功能。

II. 在拟南芥中基因功能验证

（5）敲除同源拟南芥基因。

（6）构建基因表达载体，将目的基因与质粒用DNA连接酶连接起来。

（7）载体的农杆菌转化。

（8）农杆菌与拟南芥共培养。

（9）根据载体选择合适的抗生素，筛选转化的拟南芥。

（10）PCR测定转化的拟南芥，测量拟南芥脂质合成和分泌的量。

技术路线

实验方案

1、查找大豆基因

符合条件的大豆基因可能直接在文献及数据库检索有困难，故可先在酵母中寻找能够增强脂质分泌的酵母基因，再寻找同源的大豆基因。

（1）通过查阅文献筛选文献的方式在酵母中查找与油脂合成与外泌有关的基因。

（2）通过相关网站分析在大豆中找出与酵母基因同源的基因，可在NCBI BLAST上分析或者在酵母跟大豆的数据库中查找。

2、大豆基因克隆

（1）从核酸数据库中获得上述大豆基因编码序列。

（2）从大豆中提取总RNA。

（3）逆转录获得大豆细胞的cDNA。

（4）PCR扩增目的基因（重点是PCR引物的设计）。

（5）PCR产物的琼脂糖凝胶电泳回收。

3、大豆克隆基因的表达与表达产物功能验证

I. 在酵母中基因功能验证

（1）获取缺少大豆同源基因的酵母突变体（mutant）。

（2）转化，将转化子进行表型分析及PCR鉴定。

（3）选取6-10个重组酵母菌株进行小规模蛋白质表达，测定脂质合成和分泌的量，测定时利用气象色谱或者质谱的方法进行测定。

（4）表达量最高的重组酵母菌株进行大规模蛋白质表达，确认同源基因的功能。

II. 在拟南芥中基因功能验证

（5）敲除同源拟南芥基因。

（6）构建基因表达载体，将目的基因与质粒用DNA连接酶连接起来。

（7）载体的农杆菌转化。

（8）农杆菌与拟南芥共培养。

（9）根据载体选择合适的抗生素，筛选转化的拟南芥。

（10）PCR测定转化的拟南芥，测量拟南芥脂质合成和分泌的量，利用气相色谱或者质谱的方法进行测定。

可行性分析

1、通过前期资料积累得知ABC transporters确实可以在植物中介导脂质运输，且已克隆到若干与脂质运输相关的酵母基因。

2、本项目小组所处实验室在分子生物学研究方面技术成熟，发表相关的多篇SCI论文，实验室的科研经验足以保证这项研究的顺利开展。

3、本项目小组组员都具备科研素质和一定的实验技能，并熟练掌握研究所必备的基础知识，对研究目标，研究内容，研究方案有清晰准确的认识，且已经制定出一套完整的实验方案。

4、基于以上事实，项目具备可行性。

4. 研究创新点

特色或创新之处

1、通过已经利用abc transporter保守序列，从大豆，拟南芥全基因组中直接筛选比对，得到与脂质运输和分泌相关的序列。

2、通过缺失基因的突变体验证基因功能。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

2016.12-2017.02 对f1代拟南芥转基因个体进行筛选，确定是否成功转入了相关基因，同时培育f2代

2017.03 对f2代收获的种子进行鉴定，同时进行相关油脂测定，分析相关数据，得出结论。