Rho参与热胁迫调控灵芝三萜生物合成的初步研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1. 国内外研究近况

灵芝三萜是灵芝的关键药用成分之一，对多种疾病的辅助治疗具有重要作用，具有广阔的开发前景。关于灵芝三萜的研究，大量集中在对其分离纯化、结构测定以及药理活性方面，灵芝三萜生物合成相关的研究相对较少。近年来，灵芝三萜的生物合成途径及产量调控受到越来越多研究者的青睐。

1．1 热胁迫对生物生长发育的影响

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：Rho1对热胁迫调控灵芝三萜生物合成的影响

研究内容：1.HS条件下，WT和Rhoi处理后的HSP和灵芝三萜的含量2.添加ROS清除剂后，WT和Rhoi处理后的ROS相关酶活以及HSP和灵芝三萜的含量

拟解决的关键问题：Rho在HS条件下的作用；Rho通过ROS调控热胁迫下灵芝三萜合成的机制。

3. 研究的方法与方案

研究方法： 热胁迫处理方法：1.平板培养：灵芝菌株在pda平板上正常培养3天，42℃热胁迫处理20min后，放回28℃恢复生长2天。检测胞内ros以及ros相关基因表达量时，将在pda平板上正常生长5天的灵芝菌株42℃处理20 min，立即用ros荧光探针dcfh-da孵育或收集样品提取rna。2.液体发酵培养：250 ml锥形瓶中装100 ml cym培养基，接种8块直径6 mm的灵芝平板种，在摇床中以150 r/min转速，28℃培养7天，获得液体种子待用。液体灵芝种子经过无菌破碎，以3%的接种量转接到100 ml cym液体培养基中，以150 r/min、28℃震荡培养5天，而后42℃热胁迫静置处理12 h，28℃静置恢复生长至第7天。收集锥形瓶内全部菌丝，用自来水冲洗干净，置于无纺布上，放入烘箱，60℃烘干至恒重，天平测量菌丝干重并按照方法测定总灵芝酸及其中间代谢产物的含量。在需要添加nac、vc以及dpi等的实验中，平板菌丝用10 μm dpi、1 mm nac、2 mm vc等预处理样品30 min，液体发酵菌丝用10 μm dpi、0.5 mm nac、1 mm vc等预处理30 min，而后进行热胁迫处理。3.总三萜含量测定：(1)以灵芝三萜a为标准品绘制标准曲线。(2)三萜测定：不同处理的菌丝置于28℃摇床培养7 d，去除培养基收集菌丝，置于60℃烘箱烘干至恒重，将其研磨成粉状待测。样品制备：精密称取200 mg 60℃烘干菌丝粉，小心放入10 ml容量瓶中，加入95%乙醇定容，超声波破壁2 h，期间每20 min摇动一次，取8 ml37℃静置过夜，60℃旋转蒸干，加入0.5 ml甲醇溶解，溶解液置于1.5 ml离心管中，离心后，使用一次性0.22 m有机相滤器过滤，通过uplc (ultra-performance liquid chromatography)检测。羊毛甾醇和鲨烯含量uplc定量分析：(1)准确称取研磨好的菌丝样品0.03 g，加入1.2 ml 10% koh-75%乙醇溶液，50℃皂化2 h，每30 min摇匀一次。(2)提取液6000 rpm 离心10 min，吸取1.2 ml上清液至新离心管中。(3)用1.2 ml正己烷萃取3次。(4)收集正己烷层(上层)，氮气吹干，干燥样品用0.3 ml甲醇溶液超声溶解，待有机相滤膜过滤后，用uplc检测。4.基因表达的qrt-pcr分析：为了测定基因表达，将菌丝体在pda平板上培养，然后如前所述用一层无菌玻璃纸覆盖，之后收集菌丝体并在液氮中冷冻。提取总rna，使用持家基因18s rrna进行基因表达的相对定量，wt的样品用作参考样品，针对所有其他处理和转化体进行比较;参考样品的表达被定义为1.0，并且所有其它处理和转化体中的参考基因的表达被报告为相对于参考样品的倍数增加。5.测定酶活性：将菌株培养在pda平板上，其覆盖有一层无菌玻璃纸。然后在液氮中冷冻并储存在-70℃下，直到菌丝体被研磨，并提取酶。将冷冻菌丝体（0.3g）在5ml含有1mm edta和1％聚乙烯吡咯烷酮的50mm磷酸钾缓冲液（ph 7.0）中匀浆。将匀浆在4℃下以15,000g离心20分钟，并将上清液立即用于随后的酶测定。根据bradford方法，使用bsa作为标准物测定蛋白质含量。测定超氧化物歧化酶活性：监测硝基蓝四唑（nbt）的光化学还原的抑制。将sod活性的一个单位定义为考虑到对照混合物的吸光度为100％，抑制nbt的光化学减少50％的酶量。cat活性测定为240nm处h ₂ o ₂分解的速率，h ₂ o ₂ /分钟的分解速率显示cat的活性。apx活性通过apx测定试剂盒在290nm下进行分光光度法测量。使用细胞谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒在上清液中测量gpx活性（nmolnadph/minml），其在从gpx介导的还原中氧化谷胱甘肽的谷胱甘肽还原酶（gr）循环期间测量nadph的偶联氧化的过氧化叔丁基。在该测定中，根据制造商的手册添加过量的gr，谷胱甘肽和nadph。6.所有实验需重复至少三次，具有相同或相似的结果。各个实验的平均值表示为平均值标准误差（sd）。对每个数字使用适当的统计测试。使用学生t检验分析两个比较的样品。duncan的多范围检验用于多重比较。p值0.05被认为是统计学显着的。

实验方案：hs处理wt，检测rho基因表达量变化情况；测定ros及其相关酶的活性。检测灵芝的三萜含量

技术路线：1.热胁迫能够诱导ros产生，ros能调控灵芝三萜的生物合成

2.热胁迫能够诱导rho表达的增加，rho表达的增加能够促使灵芝产生ros，ros的产生能够调控灵芝三萜的生物合成

4. 研究创新点

本课题首次提出了Rho1参与调控热激诱导的灵芝三萜的生物合成，通过HS处理后，检测Rho基因的表达量及其影响灵芝三萜的合成，探索Rho对灵芝三萜的生物合成的影响，将为次生代谢产物的调控机制的进一步完善提供初步证据。

5. 研究计划与进展

2016.12-2017.4 hs处理wt后，rho基因的表达量的测定完成

2016.12-2017.4 ros及其相关的酶活测定完成

2017.3-2017.4 灵芝三萜的测定完成