水稻谷蛋白57H突变体的鉴定与基因定位开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 本课题研究意义 1.1 地木耳的分类地位地木耳（Nostoc commune Vaucher）又称为地软、地皮菜、地耳、地捡皮等，属蓝藻纲（Cyanophyceae）、念珠藻科（Nostocaceae）、念珠藻亚科（Nostocoideae）、念珠藻属（Nostoc）藻类。念珠藻亚科包括5 个属，在我国报道了 3 个属，分别为管链藻属（Aulosira）、节球藻属（Nodularia）和念珠藻属（Nostoc）。念珠藻属在我国报道了 25 个种和 2 个变种，常见的有地木耳（N. commune）、发状念珠藻（N. flagelliforme）和球状念珠藻（N. sphaeroides）等 16 个种[1]。1.2 地木耳的生态价值和吸附性地木耳含有丰富的多糖、蛋白质以及氨基酸等营养物质，具有抗肿瘤、抗氧化等作用[2]，重要的是，对生态环境中的重金属离子有显著的吸附作用，并且成本低、广泛易得、不会产生二次污染[3]，是一种具有良好吸附重金属离子的生物吸附剂。生物吸附技术作为新发展起来的处理重金属污染的技术，与传统技术相比具有原料来源丰富、品种多、成本低等优势[4]，地木耳在吸附重金属后，可以通过一些手段将重金属离子洗脱，处理后再重新吸附重金属离子。地木耳的表面积巨大，因此重金属离子量吸附较大。1.3 本课题的研究意义本课题通过调整培养基中大量元素的含量，来检测原本吸附在地木耳中的重金属离子含量的变化，从而筛选能够事地木耳吸附更多重金属离子的培养条件，提高其吸附效果，在今后改良人工培养的地木耳作为重金属生物吸附剂来吸附重金属离子的方面，有着重要的意义。2 地木耳的研究现状地木耳菌分布广泛，在我国几乎所有省市都有报道[3]；人工培养的方式有荒坡地土壤中直接培养方式、室内摇瓶培养方式、室外跑道式培养池培养方式等。2.1 地木耳吸附重金属离子的研究现状地木耳的结构特性、吸附机理与吸附能力均表明，它们吸附技术在处理重金属废水方面具有广阔的应用前景。利用地木耳可以吸附重金属离子的特点进行重金属污染水体的修复，国内外在念珠藻类生物的耐受性、吸收机理以及生产应用方面均取得了一定的进展[5]。不过，作为新兴的生物修复技术，包括我国在内的很多发展中国家，在利用地木耳对重金属污染水体的修复方面尚处于起步阶段，还存在诸多的不足之处。2.2 地木耳现研究阶段待解决的问题首先，地木耳对环境适应的问题，虽然在实验条件下富集能力较强，不过它在自然条件下，生长环境有限，我国只有云南程海有较多的分布[6]；其次，大规模的地木耳修复污染水体的应用，涉及到它们的收集及合理的固定问题，藻类个体直径较小，收集困难，针对这些藻体的合理开发以及固定化技术的研究，显得很有必要；第三，环境与资源科学与生命科学领域等其他学科的交叉有待深入。目前，我们对地木耳的生物修复机理、胞内外的具体吸收途径等方面的机理并不是完全清楚，并且藻类对重金属离子的抗性、吸附能力还需在生物技术的帮助下，进一步的提高；最后，综合治理水体污染技术逐步转化为工业生产和商业价值的问题，如开发修复重金属污染的菌藻共生综合系统、回收贵重金属等问题，也有待于更好地解决[7]。3 地木耳的应用前景就地木耳菌自身而言，它的分布非常广泛，但野生资源日益减少。目前地木耳来源主要是野生地木耳菌体[8]，但野生地木耳生长受到特定的气候、土壤、生物因素影响。由于环境污染日益加剧，导致某些地区地木耳中重金属元素超标，使其不能有效利用。并且，由于野生地木耳菌体的皱褶中包含大量的泥沙、苔藓、杂草等不易清除，使野生地木耳大量应用受到一定的局限。不同地区的地木耳营养成分及生物活性差别大。因此，有必要对地木耳的遗传人工培养等进行研究，对其培养过程中体内的重金属离子含量变化加以研究分析，以便开发与利用地木耳资源。本课题通过对地木耳样品进行研究，对改善地木耳的重金属离子吸附性能、改变地木耳中的有害成分有重要的意义，同时对研究人工培养基培养地木耳的条件、地木耳吸附重金属离子的条件方面，有较高的应用价值。参考文献：[1] 刘瑞玉.中国海洋生物名录[M].北京：科学出版社,2008.[2] 张永亮,张浩江,谢水波等 藻类吸附重金属的研究进展 铀矿冶 2009.2 28(4):31-37[3] 江用斌,季宏兵 藻类对重金属污染水体的生物修复[J] 地理科学进展,2007.7 26(1)：56-67[4] 任洪强,陈坚,伦世仪.重金属生物吸附剂的应用研究现状[J].生物技术,2010,10(1):33-36.[5] Rangsayatoma N, Upathamb S, Kruatrachuea M, et al. Phytoremediation potential of Spirulina (Arthrospira) platensis: biosorption and toxicity studies ofcadmium[J]. Environmental Pollution, 2012, 119:45-33.[6] De Philippis H, Vincenzini M. Exocellular polysaccharides from cyanobacteria and possible applications. FEMS Microbiol Rev, 2011,22: 151~175.[7] Prasad B, Pandey C. Separation and preconcentration of copper and cadmium ions from multielemental solutions using Nostoc muscorum-based biosorbents[J]. World Journalof Microbiology and Biotechnology, 2000, 16(8-9): 819-827.[8] 朱雪强,韩宝平.重金属生物吸附研究进展[J].中国环保产业,2004,5:19-21.

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标通过对地木耳培养基大量元素用量的改变，测定已吸附重金属离子的地木耳体内的重金属离子含量的变化，筛选能够事地木耳吸附更多重金属离子的培养条件，提高其吸附效果，为今后改良人工培养的地木耳作为重金属生物吸附剂来吸附重金属离子的方面，提供有效的实践意义。2.研究内容1）基础培养：配制BG11人工培养基，接种地木耳，在实验条件下培养；2）重金属处理：配制Cd2 重金属溶液并接种到地木耳培养基中，测定初始镉元素含量；3）培养一定时间后，将地木耳接种到无镉的培养基中去，无镉培养基分为3组，两组的N元素含量分别按正常量增减50%进行配制，第三组为空白对照；4）三组材料每3-5天为一个周期，测定地木耳体内的Cd元素含量的变化情况，进行统计数据并做显著性分析，筛选最为有效的培养条件。3. 拟解决的关键问题地木耳在人工培养条件下，对重金属离子有一定的吸附作用，不过这种研究目前在我国还处于起步阶段，如吸附量较低、吸附效率较小等，本课题希望通过实现人工培养集中大量元素氮元素的变化，来研究元素变化对地木耳体内富集的重金属离子含量的改变，能够筛选出有较高的吸附效率的人工培养条件。

3. 研究的方法与方案

1、研究方法1）BG11培养基成分如下图所示；2）地木耳实验培养条件：摇床摇动速率为40rpm，培养温度25℃，培养时间16小时光照/8小时黑暗；3）ICP-AES法测定地木耳体内的Cd元素含量：电感耦合等离子体发射光谱法，将地木耳浸泡，用自来水冲洗干净泥沙，再用蒸馏水反复冲洗，最后用去离子水冲洗，放入冲洗干净后的烧杯中，在60℃下干燥48h，在80℃下干燥6h。在研磨成粉状后过40目筛，放入干燥器中保存，备用。将不同居群地木耳样品等量混合。称取地木耳、黑木耳和黄伞粉末1.0000g，倒入聚四氟乙烯消解罐中，在消解罐中加入10mL浓硝酸与高氯酸混合液（浓HNO3:高氯酸=3:1），加盖密封放置24h后，在电热板上低温消化2h，待白烟冒尽后，升温到 100℃下2h，冷却静置过夜。消解结束后将溶液转移到50mL 容量瓶中，加入5mL0.5mol/L的HCl，用优普超纯水定容，同步做一空白试验，每个样品重6次。实验仪器为全谱直读电感耦合等离子体发射光谱仪，配制各元素的标准曲线，浓度分别为0、1.0、5.0、10.0、50.0μg/m L，线性相关系数达到0.9998，根据标准曲线对样品进行分析。本试验采用标准曲线系列，在实验条件下，平行制备11份样品空白溶液，计算出检测限及相对标准偏差（RSD）。2、技术路线配制培养基接种、培养地木耳接种Cd2 溶液接种实验和对照组培养基显著性分析|| ||测定镉元素含量 测定镉元素含量3、实验方案1）地木耳培养干样品吸水活化后消毒处理，研磨过滤得到滤液；2）配制BG11培养基，并将地木耳接种到培养基中培养，每500ml一个锥形瓶，预计配制10瓶左右；3）培养条件为摇床摇动速率为40rpm，培养温度25℃，培养时间16小时光照/8小时黑暗；4）ICP-AES法测定此时的地木耳体内的Cd元素含量，按照湿法消解等步骤进行； 5）配制Cd2 重金属溶液，元素浓度为10mg/L（配制1000mg/L的母液，用时稀释）；6）将Cd2 溶液接种到地木耳培养基中，按照第3步的培养条件进行培养；7）培养一段时间后测定地木耳体内的Cd元素含量并记录；8）将Cd处理过的地木耳从含有Cd2 的培养基中取出，均分三组，重新接种到无重金属离子的培养基中去，第一组接种到BG11培养基上，作为空白对照；第二组接种到增加50%N元素质量的BG11培养基中，第三组接种到减少50%N元素质量的BG11培养基中，其他均按照第3步条件培养；9）三组材料每3-5天为一个周期，测定地木耳体内的Cd元素含量的变化情况，进行统计数据并做显著性分析，得出实验结果。4、可行性分析本实验工作主要是在南京农业大学国家重点实验室陆巍副教授实验室开展和进行的。本实验室师资力量雄厚、配套实验设备齐全、在研课题多样，这为本实验工作的开展和进行提供了优越的实验条件和充足的信息来源，指导教师具有丰富深厚的分子生物学基础。

4. 研究创新点

近年来由于生态环境的污染问题日益凸显，在重金属污染治理的方面也越来越受到人们的关注，生物治理重金属污染的方法成本低、原料易得、收效明显，并且不会产生二次污染，因此受到科学家们的广泛关注。目前国内外在针对地木耳菌治理生态环境中的重金属离子污染方面进行的研究较少、进展较慢，但藻类的生物防治具有非常重要的意义。本课题中，通过对地木耳培养基大量元素用量的改变，测定已吸附重金属离子的地木耳体内的重金属离子含量的变化，筛选能够事地木耳吸附更多重金属离子的培养条件，提高其吸附效果，为今后改良人工培养的地木耳作为重金属生物吸附剂来吸附重金属离子的方面，提供有效的实践意义。

5. 研究计划与进展

1、2017年3月前：地木耳培养干样品吸水活化处理、配制bg11培养基，并接种培养；

2、2017年4月前：测定地木耳体内的cd元素含量，配制cd2 重金属溶液、接种培养;

3、2017年5月前：测定地木耳体内的cd元素含量，将cd处理过的地木耳从含有cd2 的培养基中取出重新接种到无重金属离子的培养基中，测定并分析其变化。