1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 本课题研究意义
1．1 丰富脂信号转导通路
脂磷酸磷酸酶（lpp1）的作用是催化dgpp ( 焦磷酸甘油二脂)去磷酸化生成pa（磷脂酸），并进一步催化pa（磷脂酸）生成dag(二酰基甘油)。它在细胞膜上的作用主要用于维持dgpp ( 焦磷酸甘油二脂) 、pa（磷脂酸）dag（ 二酰基甘油)三种物质的平衡[1]。盐胁迫下，拟南芥细胞中的dgpp(焦磷酸甘油二脂)和磷脂酰基醇-4,5-二磷酸含量会明显上升[1]。这说明盐胁迫下，脂物质参与了植物细胞内的盐信号途径
2. 研究的基本内容和问题
1研究目标：
1.1明确atlpp1基因在植物中对于外界盐害响应的分子机制；
1.2初步揭示一条新的植物抗盐的信号途径，为提高农作物的产量提供遗传依据。
3. 研究的方法与方案
1 研究方法 1.1 利用转基因技术获得实验相关的遗传材料 1.2 利用组织染色的方法获取AtLPP1基因表达的组织部位，荧光标记的方法获取LPP1蛋白的亚细胞定位 2 技术路线： 2.1 鉴定出LPP1的纯和突变体植株，在150mmolNaCl盐处理的情况下比较lpp1纯和突变体与野生型WT抗盐的表型； 2.2 利用转基因技术构建lpp1的回补、过表达株系，在150mmolNaCl 盐处理情况下比较回补型、过表达型、野生型的抗盐表型； 2.3 利用转基因技术构建AtLPP1基因的GUS表达载体，进行染色分析基因的特异性组织表达； 2.4 构建AtLPP1-GFP瞬时表达载体，在PEG4000的条件下诱导原生质体的瞬时表达，在荧光显微镜下定位LPP1蛋白的亚细胞分布。 3 实验方案 3.1 拟南芥野生型材料为Columbia（Col-0）和T-DNA插入AtLPP1的缺失突变体为lpp1（SALK-129705购于Arabidopsis Biological Resource Center）以及CRISPR Cas9构建的lpp1突变体库； 3.2 检索TIGR数据库中拟南芥的基因组信息。克隆出AtLPP1的启动子和CDS序列并构建出AtLPP1基因的过表达、回补、GUS的转基因株系； 3.3 通过遗传学的方法，获得纯和的突变体材料和转基因材料； 3.4设置8组实验，4组盐处理（如图1），观察不同条件处理下，拟南芥的萌发期的长短和生长阶段的的表型； 3.5 AtLPP1基因的组织特异性表达（如图2），取种子和生长期各个组织进行染色分析；构建AtLPP1：：GFP瞬时表达载体采用PEG4000转化原生质体，在荧光显微镜下可以定位LPP1蛋白亚细胞的位置。从而揭示抗盐的分子机制，以及找出作用的部位。 4 可行性分析; 4.1在以往的报道中，我们可以了解到AtLPP1基因在盐处理的拟南芥幼苗地上部分能诱导增强表达，与野生型相比，其突变体的耐盐性显著下降；突变体体内积累更多的钠离子，钾离子流失明显较多；长时间盐处理lpp1细胞膜比野生型受到更大伤害，并且可知LPP1蛋白可能定位在细胞膜上； 4.2本实验室前期工作已证实LPP1在一定程度上参与了对干旱和盐害的响应； 4.3 lpp1 T-DNA插入型纯和突变体已经鉴定完成，利用CRISPR Cas9方法构建的突变体库正在进行转基因阶段； 4.4 AtLPP1基因的回补、过表达、GUS、GFP表达的转基因载体已经构建完成。 |
4. 研究创新点
1. 将从生理生化、遗传和细胞生物学水平揭示LPP1应答盐胁迫的分子机制
2. 揭示LPP1调节的信号通路，丰富植物脂信号转导途径
5. 研究计划与进展
1 研究计划:
该项目计划周期为一年，从2016年 9月1日起至2017年 5月1日止。我们计划将项目实施过程分为三个阶段，具体计划如下：
1.1 2016年9月1日至2016年9月30日为实验前期，在这段时间内计划任务：完成lpp1的cds序列，lpp1启动子的克隆，并构建过表达型、gus的相应载体，并了解lpp1的crispr cas9 的载体构建方法。
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