1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
1本课题意义研究神经干细胞不对称分裂的调控与细胞命运决定一直是干细胞研究领域的重要内容,神经干细胞具有自我更新和分化的潜能,既可以通过对称分裂以扩充干细胞库,也可通过不对称分裂的分裂方式以形成神经元、胶质细胞等。
神经干细胞不对称分裂机制可以通过不对称分裂过程中的一些不对称特性来达成,如胞内细胞命运决定子的不对称分配,或者将子细胞不对称地置于不同的外部微环境等。
而不对称特性中被视为最重要最吸引人的一点即是干细胞在分裂中子代姐妹染色体上本身存在的不对称特性。
2. 研究的基本内容和问题
1研究目标首先通过dapi染色标记特定品系24hpf/30hpf/36hpf/48hpf斑马鱼幼体的视网膜神经干细胞中正处于g2期分裂期的复制后两套染色体,再通过dna-fish(dna fluorescence in situ hybridization)的方法标记具体的ath5等位基因位点,之后再通过rna-fish(rna fluorescence in situ hybridization)在体外检测ath5在两套染色体的转录激活状态,最后可以借助斑马鱼模型的优势,用一种简易的基于pcr 基因组标记策略(genomic-tagging strategy ,m-tag)来进行在体的标记检测ath5在两套染色体的转录激活状态。
2研究内容2.1斑马鱼幼体的获得,冰冻切片在受精后24h/30h/36h/48h分别收集斑马鱼特定品系的胚胎,剥壳,收集幼体鱼进行4%多聚甲醛固定,之后更换为30%的蔗糖溶液脱水。
使用oct将幼鱼包埋冷冻,获得鱼体眼睛的冰冻切片。
3. 研究的方法与方案
1研究方法1.1 斑马鱼幼体的获得,冰冻切片在受精后24h/30h/36h/48h分别收集斑马鱼特定品系的胚胎,剥去卵壳,收集幼体鱼进行4%多聚甲醛固定6-8h(可过夜),之后更换为30%的蔗糖溶液使之脱水。
在干冰盒中使用oct将幼鱼包埋(包埋角度很关键),获得鱼体眼睛的冰冻切片。
1.2 dapi免疫染色dapi,4,6-联脒-2-苯基吲哚,是一种常用的荧光染料。
4. 研究创新点
以往对不对称分裂的研究往往着重于细胞极性确立、纺锤体定位、细胞组分的不对称分配等,即使是对重要转录因子与细胞命运决定的研究,也只是在细胞表达的有无强弱层面,未曾深入到探究复制后两套姐妹染色体上单个转录因子基因位点本身转录激活的不对称特性。
本课题从等位基因位点的角度切入来探究ath5的转录激活是否存在不对称特性及与rgcs命运决定关系,在神经干细胞不对称分裂的众多研究中是很独特新颖的一个切入点。
另外,斑马鱼作为模型可以很方便地进行分子遗传操作,并在脊椎动物模型中具有不可比拟的在体操作和观测生理活动的优势。
5. 研究计划与进展
2017年1月-2月:完成实验室基本操作的训练,如冰冻切片、dna-fish、rna-fish等。
获得实验样本。
2017年3月:摸索实验条件,改善protocol,初步分析数据。
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