菜粕中硫甙降解菌株的分离鉴定及发酵条件优化开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

菜粕是油菜籽经各种物理工艺压榨和漫出等工序，制取分离出油脂后的残留物。油菜籽在中国和世界上都是重要的油料作物之一，我国更是世界油菜生产大国，我国油菜籽产量超过1400万吨/年，菜籽粕产超过900万吨/年，油菜种植面积和油菜籽产量均居世界第一位，其中以湖南、湖北、江苏、安徽、四川五省的种植面积和产量最大，占全国的比例均超过60%^[1]。

菜粕营养丰富，依不同的油脂提取工艺，粗蛋白在35%-45%，其中90%-91%属于可消化蛋白，部分矿物质及韩流氨基酸的含量甚至比豆粕还高，另外含粗脂肪2%-3%、碳水化合物24%-30%、纤维素8.1%-9.0%、灰分4.5%-5.2%、消化能11.2%-12.3%兆焦/千克、代谢能9.95-10.99兆焦/千克,与应用最广泛的蛋白饲料,另外还含有丰富的常量和微量元素,其中钙、硒、铁、镁、猛、锌的含量比豆粕的高,磷含量是豆粕的2倍,微量元素Se的含量是植物性蛋白中含量最高的^[2]。

菜粕中所含的有毒有害物质限制了其在养殖中的应用，如硫葡萄糖甙、植酸、单宁等，其中以硫代葡萄糖甙最为重要。硫代葡萄糖甙(Glucose inolate，缩写GS) 简称硫甙，是糖与另一种非糖物质通过糖的羰基碳原子连接而成的化合物，它们在抗癌、植物防御和风味形成等方面有重要作用，至今已发现有110多种,它们广泛存在于十字花科植物中，是十字花科植物中重要的次生代谢产物，特别是在芸苔属的各种植物中，如油菜、白菜、萝卜等，榨油后残留在油渣中^[3]，是一类含硫化合物。因为它们的R-基团不同，可把它们分为脂肪族硫甙（第一类）、芳香族硫甙（第二类）和吲哚族硫甙（第三类）。其中菜籽粕中主要有8种，见表1-1。

表1-1菜籽粕中硫甙的种类

Table1-1 The maintypes of glucosinolate in rapeseed

硫代葡萄糖甙本身并无毒，但水解后产生有毒物质(可在菜籽粕、饲料的贮存过程和动物消化道内发生)，主要有4类:异硫氰酸盐(ITC)、唑烷硫酮(0ZT)、硫氰酸盐(Thiocycauate)和腈(Nitrile) ，这些毒素能使动物甲状腺肿大并出现多种中毒症状^[4]。

几十年来，国内外许多科技工作者进行了大量的基础研究和应用研究，提出了许多脱毒工艺或方法，为高效利用菜粕做出了巨大的贡献。目前所有菜粕的脱毒方法总体来说可分为四大类，即物理脱毒法、化学脱毒法、生物脱毒法和遗传育种法。

（1）物理脱毒法包括热处理法、微波辐射法、挤压膨化法以及微粉碎法。物理方法作用机理是以110℃以上高温杀灭菜粕中的微生物,钝化芥子酶与其它酶系，高温可将硫甙以及其它抗营养因子部分分解,有些成分则分解为可挥发性物质而随蒸气散失掉。菜粕中的硫代葡萄糖甙可以在高温下部分降解,动物采食后，空气、水、动物肠道及饲料中的微生物的芥子酶都能使剩余的芥子甙降解而重新引发毒性，所以用物理方法处理菜籽饼仅具有暂时的脱毒性，不完全可取。

（2）化学脱毒法^[5]可分为酶催化水解法、酸碱盐降解法和溶剂浸出法。它是利用化学溶剂的性质与菜粕中硫代葡萄糖甙的化学结构与性质进行的处理方法，化学方法的基本原理主要是针对菜籽饼中某些有毒成分的某种特性,进行固定、中和、分解、溶解等，以减少其毒性。但由于处理的针对性强，作用专一，故往往会顾此失彼,很难达到预期的结果。

（3）微生物脱毒法较为理想。因微生物种类多,数量大,适应性强，生长快，易培养，酶系复杂，不仅分解硫甙的芥子酶多样，能够水解复杂多变的硫甙，而且分解降解产物的酶系也复杂,能将其彻底分解，并合成自身物质;同时菜粕的其它抗营养因子也能被微生物分解,如植酸、单宁、纤维素等,大大地改善了菜粕的口感,提高了菜粕营养成分的利用率;微生物利用自身代谢作用，可以产生香味物质或香味的前体物质，提高菜粕脱毒后的香味，进--步提高蛋白质含量。因此利用微生物对菜籽饼脱毒是--种较理想而有前途的脱毒方法，而微生物脱毒又以固态发酵常用。

（4）遗传育种法^[5]是一种解决抗营养因子的最根本的方法。目前，加拿大和欧洲各国大力培育推广“双低”油菜品种,其特点是芥酸含量低，菜粕中硫甙的含量极少。上世纪80年代，菜粕中硫甙含量较高，一般在125-207 μmol/g，平均在166 μmol/g (绝干，不含油)，随着基因工程技术的开展，法国培育出低硫甙的菜籽品种，硫甙平均含量可降低至38 μmol/g，一般在9-69μmol/g (绝干，不含油) ^[6]。如今，加拿大培育出更低硫甙含量的菜籽品种Canola,硫甙含量低于25 μmol/g (绝干，不含油)。

目前鉴定硫代葡萄糖甙的主要方法包括气相色谱测定异硫氰酸酯类化合物、HPLC测定脱硫硫代葡萄糖甙和完形硫代葡萄糖甙^[7]。用质谱方法鉴定硫代葡萄糖甙包括化学电离(CI) ^[8]、快速原子轰击电离(FAB) ^[9]及热喷雾电离(TSPI) ^[10]等方法。

本研究采用微生物发酵法对硫甙进行降解，以硫甙为唯一的碳源对菌种进行大量富集，筛选出硫甙脱毒菌株，对其进行分离、鉴定、形态学观察，并对发酵条件进行优化。

2. 研究的基本内容和问题

本实验的研究目标是探究菜粕中硫甙脱毒菌株的分离鉴定与发酵条件的优化，将菜粕进行降解处理，提高菜粕的利用价值，填补我国蛋白质饲料资源的短缺，使养殖业与畜牧业蓬勃发展。

本实验的主要研究内容是从油菜地和菜粕堆积地中采集土壤样品，以硫甙为唯一碳源的土壤混合液对菌种进行大量培养。通过传代培养对菌种进行富集，筛选出硫甙脱毒菌株，对其进行分离鉴定。对发酵条件进行优化，得到最优发酵条件，提高菜粕的利用价值。

本实验拟解决的关键问题是提取硫甙时存在一定的人为误差，必须进行大量提取，但是必须保证每一次提取硫甙的浓度差别不大。菜粕中除硫甙外还含有的多种抗营养因子，如植酸、单宁等，难以将菜粕的利用价值最大化，并且硫甙无法完全降解，菜粕中依旧会有有毒物质的存在，无法完全避免动物服用后的中毒现象。因此，在实验室研究脱毒菌株时，因尽可能获取毒素更低的硫甙脱毒菌株，从而获得利用价值更高的菜粕，为养殖业和畜牧业的发展增添色彩。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

采集油菜地和菜粕堆放地的土壤样品，将土样加入到的无机盐培养基中对菌种进行大量培养，通过传代对菌种进行富集，将筛选出的菌种进行分离纯化，得到高效硫甙脱毒的菌种，进行分离纯化以及鉴定。将获得的单菌落进行混合，进行混菌发酵。确定最优的一组混菌组合，通过单因素实验和正交实验对其发酵条件进行优化，确定最优发酵条件。通过本实验对菌种富集可以大量获得硫甙降解的菌株，减少了分菌实验的工作量，并且为提高菜粕利用价值提供了技术依据。

2.技术路线

4. 研究创新点

目前对硫甙有脱毒效果的菌株主要是黑霉、曲霉、枯草芽孢杆菌或者酿酒酵母等菌株，但其对硫甙的降解效率都不高。本实验从土壤混合液中筛选出一株能够高效降解硫甙的菌株，通过传代对菌种进行富集，将获得的单菌落进行混合，进行混菌发酵；这样做不仅可以大量获得硫甙脱毒菌株，而且减少了分菌实验的工作量，为提高菜粕利用价值提供了技术依据。

5. 研究计划与进展

2019.11-2019.12 阅读文献，撰写文献综述，了解实验理论基础及方法

2020.01-2020.04 粗提硫甙，对硫甙脱毒菌株进行分离鉴定及发酵条件优化

2020.05-2020.06 处理数据，分析结果，完成毕业论文与答辩