菌株Pigmentiphaga sp. H8中3个4-羟基苯甲酸羟化酶的酶学特性比较开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 研究意义

卤代羟基苯甲酸是一类重要的化工中间体，具有稳定性好、耐疲劳、阻燃、耐热等特性，广泛用于工农业生产，如农药、染料、医药、助溶剂和阻燃剂等[1-2]。由于卤代羟基苯甲酸具有难降解、高毒性等特点，被列为“持久性有机污染物”（ persistent organic pollutants, pops）和“优先控制污染物”（priority pollutants）[3-4]。而且由于卤素原子的强电子吸附作用使得卤代羟基苯甲酸的分子极性增加，易与生命细胞内的酶系统结合进而对细胞产生毒性[5]，导致其对环境安全和人类健康具有潜在的威胁。因此，为了适应卤代羟基苯甲酸的毒性环境，细菌进化出了多种类型卤代羟基苯甲酸的代谢途径[6-7]。代谢调控是微生物适应环境变化并作出应答的一类重要机制，在微生物适应污染物环境和降解污染物中发挥关键作用[8]。因此，研究微生物对卤代羟基苯甲酸的代谢调控机制具有重要的科学意义。

本研究前期从环境中分离筛选到一种菌株pigmentiphaga sp. h8能高效降解3-溴-4-羟基苯甲酸（3-bromo-4-hydroxybenzoate, bhb）。通过比较转录组和比较蛋白组预测分析，结合分子遗传学实验，证实了菌株h8基因组中3个4-羟基苯甲酸羟化酶基因（phbh1, phbh2和phbh3）的功能发生了特异性进化，其中phbh1和phbh2参与bhb的代谢，而phbh3参与4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoate, 4-hb）的代谢。本研究拟展开代谢产物纯化鉴定、基因功能验证、降解酶的异源高效表达、酶学特性、酶促反应动力学等研究，从生化酶学角度阐释菌株h8代谢bhb和4-hb的降解机理，揭示3个4-羟基苯甲酸-3-羟化酶基因（phbh1, phbh2和phbh3）的遗传冗余效应。本研究的预期成果不仅丰富了卤代羟基苯甲酸的微生物降解机制，为卤代羟基苯甲酸污染的生物修复提供新的菌株、基因和酶资源，也为揭示微生物适应性进化中的难题——遗传冗余效应提供了实验依据。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

本项目以菌株pigmentiphaga sp. h8中3个4-羟基苯甲酸羟化酶基因（phbh1, phbh2和phbh3）为研究对象，通过代谢产物纯化鉴定、基因功能验证、降解酶的异源高效表达、酶学特性、酶促反应动力学等研究，从生化酶学角度阐释菌株h8中3个4-羟基苯甲酸羟化酶基因（phbh1, phbh2和phbh3）的功能及遗传冗余效应。

3. 研究的方法与方案

研究方法与实验方案：

（1）基因功能验证

采用基因敲除和异源表达这两种方法，鉴定三个个代谢基因phbh1、phbh2和phbh3的功能。首先利用自杀性质粒pjq200sk，采用同源重组的方法构建一系列phbh1、phbh2和phbh3缺失的突变株h8Δphbh1、h8Δphbh2、h8Δphbh3、h8Δphbh1Δphbh2、h8Δphbh1Δphbh3、h8Δphbh2Δphbh3、h8Δphbh1Δphbh2Δphbh3，分别检测这些突变株对3-溴-4-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸的降解情况。

4. 研究创新点

本项目的创新之处：

本项目一方面将从生化、遗传角度阐释菌株pigmentiphaga sp.h8代谢3-溴-4-羟基苯甲酸（3-bromo-4-hydroxybenzoate, bhb）的新的降解机理，另一方面通过分析比较3个冗余的4-羟基苯甲酸羟化酶基因的酶学特性与功能，解析其遗传冗余效应。

5. 研究计划与进展

项目研究计划及预期进展：

通过代谢产物纯化鉴定、基因功能验证、降解酶的异源高效表达、酶学特性、酶促反应动力学等研究，从生化酶学角度阐释菌株H8代谢BHB的降解机理。