gga-miR19a与树突状细胞Wnt信号通路的相关性开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

micrornas(简称mirnas)是一些5'端带磷酸基团、3'端带羟基的，长约19～24核苷酸的非编码调控rna家族[1]，通过结合特定信使rna(mrna)来调节基因表达。mirna首先在细胞核中由Ｒna聚合酶Ⅱ产生较长的初级转录产物pri-mirna，经rnase ii drosha酶将pri-mirna的3'端和5'端切割产生长约70 nt、5'端带磷酸基团、3'端为羟基的mirna前体pre-mirna。切割后的前体pre-mirna经由exportin5/ranctp运出细胞核进入胞质基质中。再经dicer酶第二步切割pre-mirna茎-环结构环的一端形成成熟的长约21 nt的双链mirna[2]。dicer酶生成的双链mirna，其中一条链迅速降解，一条链形成rna沉默复合体(rna induced silencing complex，risc)。通常双链5’端相对更不稳定的那一条链倾向于被保留，而另一条链则会被丢弃然后降解。有的双链的两条链都可能被保留下来，并且需要在mirna的序号后面加上5p或者3p加以区分。当mirna被装载到risc复合物中后，便可以发挥其基因表达调控的作用。mirna会通过其种子序列（5端第2-8位核苷酸）识别靶基因mrna 3’-utr上的结合位点，携带risc发挥作用。成熟miＲna与靶mrna 3'utr完全或部分互补，从而抑制mrna的翻译或诱导其降解[3]。被侵染的宿主以病毒rna为模板，通过rna 依赖的rna 聚合酶合成病毒的双链rna，经过dicer切割组装成risc，降解病毒rna，抑制病毒对宿主细胞的破坏。宿主通过microrna可以抑制病毒侵染，另一方面，病毒也进化出与宿主免疫关键基因序列相似的rna，借助相似的机制生成risc，抑制或降解宿主细胞免疫相关的mrna，逃逸宿主免疫系统，并且在宿主内具有传播性，可以增强未感染细胞的易感染性。

在免疫细胞中，已报道mirnas在调节细胞发育、细胞分化和炎症介质的产生等方面具有重要作用。一些基因敲除的实验研究表明mirnas对免疫发育的关键基因起着负调控的作用，特别是在细菌病毒感染等环境压力影响的条件下。^[4]在免疫方面，microrna采取复杂的网络化方式进行调节，参与免疫细胞发育分化，抑制病原体入侵。并且与病毒逃逸免疫密切相关。主要由免疫细胞分泌的细胞因子(cytokinc ck)，通过jak/stat信号通路与相应受体结合可发挥调节免疫的作用。chun‐hua xu[5]研究报道了沉默一种microrna mir-221/222发现p-jak 2/jak 2和p-stat 3/stat 3减少，抑制mir-221/222可以上调细胞因子信号转导抑制因子3(socs3)，使jak/stat通路失活，进而抑制胶质母细胞瘤细胞的肿瘤发生。病毒microrna抑制或降解宿主细胞免疫相关的mrna，可以进而阻断宿主免疫相关受体信号通路中的关键信号分子或阻断信号分子之间的相互作用等逃逸宿主免疫系统。

家禽感染病毒可造成极高的死亡率和经济损失。 例如，马立克病病毒(mdv)和禽流感病毒可以诱发鸡的肿瘤疾病。禽流感是由甲型流感病毒引起的禽鸟间传染病,在野禽和家禽间可引起一系列不同程度的感染，常见于鸭和鹅等野生水禽。结合临床当前研究以及血凝素蛋白ha以及神经氨酸酶na抗原特点, 当前已存在有25类禽流感, 主要包括9种na亚型以及16种ha亚型。禽流感的流行和暴发不仅对世界的养禽业造成了巨大的经济损失,而且威胁到人类的健康,并对公共卫生形成日益严峻的挑战。[6]此外，甲型流感病毒(iav)具有高度的可变性，可传播到不同的物种，从而对全球公共卫生造成威胁。

2. 研究的基本内容和问题

本课题着重研究鸡的mirna gga-mir-21，目标在于寻找并证明gga-mir-21在鸡树突状细胞调控的wnt信号通路中的靶基因，以及gga-mir-21过表达和抑制对鸡树突状细胞表面蛋白表达的影响。

本研究的具体内容：质粒载体构建，通过流式细胞术探究mirna对树突状细胞表面主要组织相容性复合体ii表达的影响，通过western blot探究mirna对树突状细胞相关蛋白表达的影响，靶基因的预测和筛选，通过荧光实时定量pcr证明mirna对靶基因表达的影响，通过双荧光素酶报告基因实验进一步证明mirna与靶基因的相互作用。

本实验的关键问题主要在于：1.从鸡骨髓中提取足够多的骨髓细胞进行培养，将其诱导为树突状细胞。培养周期较长，无菌操作避免污染。2.处理细胞收集细胞的rna样品，反转录成dna进行荧光实时定量pcr。rna不稳定易分解。3.收集细胞的蛋白质以进行western blot实验

3. 研究的方法与方案

1研究方法

（1）构建含有gga-mir-21基因的质粒。

（2）流式细胞术探究gga-mir-21的过表达和抑制对鸡髓系树突状细胞表面主要组织相容性复合体ii表达的影响。

4. 研究创新点

动物病毒在宿主基因组中编码的miRNA在病毒侵染宿主过程中发挥了重要的作用，推测在鸡树突状细胞中也可能存在相同的机制，其作用机制有待进一步深入研究。

目前关于miRNA的研究主要集中在人及其他一些真核生物, 而关于动物疾病中病毒miRNA的研究较少。有关研究表明Wnt信号通路在树突状细胞的发育和成熟过程中起到重要作用，microRNA能够调控树突状细胞中的Wnt信号通路，进而影响树突状细胞的发育、成熟和迁移。但目前还未研究过gga-mir-21通过调控Wnt信号通路影响鸡树突状细胞的发育和成熟的机制。

5. 研究计划与进展

2019.12.01-2019.12.31：构建质粒载体。进行流式细胞术实验。

2020.02.01-2020.02.29：mirna过表达或抑制处理鸡树突状细胞，收集rna样和蛋白质样。进行荧光实时定量pcr。进行western blot实验。

2020.4.01-2020.04.30：靶基因-pmir载体构建。