抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的BC1F5、BC2F4及BC3F3的温室适合度开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：

油菜属十字花科（cruiferae）芸薹族（brassiceae）芸薹属（brassica），其中甘蓝型油菜（b. napus l.）、白菜型油菜（b. campestris l.）和芥菜型油菜（b. juncea l.）是主要栽培类型^[1]。

在众多油菜品种中，甘蓝型油菜是转基因研究中最为活跃的作物之一，并且也是商业化转基因作物中最主要的一种。油菜属于常异花授粉植物，其花粉能够通过风媒或虫媒进行远距离传播，花粉活力也可以保持较长时间，且其在生态环境中存在着较多的野生近源种，因此一直以来转基因油菜与野生近源种的基因漂移问题备受人们关注，已经有许多关于转基因油菜的抗性基因向芥菜（b. juncea）^[2]以及近缘杂草芜菁（b. rapa）^[3-4]、野芥菜（b. juncea var. gracilis）^[1,5]和野萝卜（raphanus raphanistrum）^[6-8]等漂移的研究报道。所以，转基因油菜的生态安全性十分值得我们去关注。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

研究抗草甘膦转基因油菜中的抗性基因在转基因油菜与近缘杂草野芥菜的正反回交1代子4代、回交2代子3代及回交3代子2代在温室条件下的适合度；并研究抗草甘膦基因在回交1代子5代、回交2代子4代及回交3代子3代的传递规律，为抗除草剂转基因油菜抗性基因向野芥菜的渗入提供科学依据。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

实验方法与实验方案：

1）实验材料：

野芥菜（B. juncea var. gracilis）采集于南京江浦，抗草甘膦转基因油菜（Brassica napus L.；genome，AACC）来自加拿大。以携带抗草甘膦基因的正反回交1代子4代（BC1F5）、回交2代子3代（BC2F4）、回交3代子2代（BC3F3）为实验材料。

2）材料种植：

材料种植在南京农业大学牌楼温室中。从经过抗性筛选和抗性检测后所存活下来的植株中挑选生长健壮、大小适中的植株，按照实验设计进行盆钵移栽。盆钵中所用土壤均一致为菜园土，并与腐殖质按1:1比例混合均匀，所用盆钵也大小一致，均为口径23cm，深24cm。每盆移栽一株。抗性油菜、野芥菜各移栽20株，每种后代各移栽60株。开花期对各植株进行套袋处理，让其自交，避免其窜粉，成熟后整株收获、考种，并收取种子。

3）适合度成分的测定：

实验中所测指标包括营养生长期指标（株高、茎粗、莲座状直径、一次分枝数，地上部干生物量）和生殖生长期指标（单株有效角果数、角果长、每角果饱粒数）。

表1 适合度成分测定及方法

4）抗性筛选和抗性检测：

抗性筛选：

将一次性塑料小杯底部打孔（口径6.5cm，深度9cm），并装满菜园土（没有野芥菜发生过），浇足水，播种所得的BC1F5、BC2F4和BC3F3种子，每杯一粒，浅盖土。置于温室中，进行正常的栽培管理。15天后统计出苗率，待植株长至四叶期时分别用草甘膦筛选2次，其中41%(a.i)草甘膦异丙胺盐（农达，孟山都公司生产，美国）（3000ppm）的施药剂量为1400g（a.i.）/ha。采用手持式喷雾器（黄岩市下喷雾器有限公司，浙江，中国），扇形喷头。每次施用至少选择野芥菜和相应的转基因油菜各30株作为阴阳对照。在药害症状明显时统计死亡和存活植株数量，对存活植株抽样进行分子检测，检测抗性基因存在与否。

抗性检测：

对存活下来的后代植株进行随机抽样，选取每种后代30株以上，以野芥菜为阴性对照，相应的抗性油菜为阳性对照，采用PCR的方法，检测抗性基因EPSPS和Bar的存在。

EPSPS的扩增引物

P1:5′ AAGGCATTCATTCCCATTTG 3′，P2:5′ TAACATCTTCACCTTCCAAAAG 3′。

按下列组分配制50μl反应体系：5μl 10Ex Taq Buffer，4μl MgCl2（25mM），4μl dNTP Mixture(各2.5mm，2μl各引物（10um），0.5μl TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶（5U/μl）(宝生物工程(大连)有限公司)，大约20ng模板DNA。PCR扩增在Whatman Biometra TGRADIENT Thermocycler上进行。反应条件如下：94℃预变性5min，35个循环(94℃变性50sec，50℃退火50Sec，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min。扩增获得的527bp产物在1%琼脂糖凝胶和120V电压条件下电泳30min。EB染色后在紫外灯下观察并拍照。

技术路线：

可行性分析：

本课题指导老师长期从事转基因油菜向野芥菜的渗入研究。在前期研究基础上已经获得了携带抗草甘膦基因的回交1代子4代、回交2代子3代以及回交3代子2代，具备实验材料。

项目组所在实验室已经具备从事分子检测所需的基本设备和仪器。

项目组在南京农业大学牌楼实验基地有150多平方米的温室，足量盆钵等，具有种植条件。

本人从2013年9月就开始和指导老师从事该项研究，清楚了解实验目的、意义，并熟悉实验方法，具备完成的可能性。

4. 研究创新点

本项目以抗草甘膦转基因油菜的BC1-3自交产生的子代为材料，研究抗性基因在回交代子代中的传递频率，在温室条件下的适合度，分析回交代随着自交代数的增加，抗性基因的传递、后代适合度的变化规律，探索抗草甘膦转基因油菜的抗除草剂基因渗入到野芥菜中的过程，为抗除草剂转基因油菜基因安全性评估提供更科学和深入的依据。

5. 研究计划与进展

2013.9至2013.12，查阅相关文献。种植回交1代子4代、回交2代子3代及回交3代子2代实验材料，进行抗性筛选。

2014.1至2014.8，移栽实验材料，测定适合度指标。

2014.9至2015.1，种植回交1代子5代、回交2代子4代及回交3代子3代，进行抗性筛选，完成实验。