转基因甘蓝型油菜C染色体基因向其与野芥菜回交后代（BC1F6，BC2F5，BC3F4）的渗入开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 本课题研究意义

油菜是我国第一大油料作物，其中甘蓝型油菜（brassica napus, 2n=38, aacc）具有角果长、种子大、分枝数和结角数多等优点，且耐肥、产量高和含油量高^[1]。通过生物技术培育的抗除草剂转基因油菜是转基因作物中推广应用面积大、开发早的作物之一，且都是甘蓝型油菜^[2]。从染色体组成上看，甘蓝型油菜是由芸薹（aa, 2n=20）与甘蓝（cc, 2n=18）通过自然种间杂交后进化而来的一种复合种。转基因油菜主要在加拿大、美国、澳大利亚和智利这4个国家种植。加拿大是转基因油菜种植的第一大国，到2015年其转基因油菜的种植面积已经占油菜总面积的93%^[3]，美国是继加拿大的转基因油菜第二种植大国，种植面积在2012年就已经高达160万公顷，其中抗草甘膦转基因油菜的种植面积最广，约占转基因油菜的46%^[4]。目前，我国虽然尚未开始商业化种植转基因油菜，但每年仍然会进口大量的转基因油菜籽用于生产加工实用油^[2]。

转基因作物在给人类带来巨大经济效益和社会效益的同时，也存在着潜在的生态风险。近年来，转基因油菜的抗性基因向野生近缘种尤其是向其生长危害较大的杂草的漂移所引发的杂草化的生态风险受到广泛的关注^[5-6]。如果抗除草剂转基因油菜的抗性基因漂移到这些杂草，并且能够使得其适合度提高，这些携带抗性基因的近缘杂草很可能因此而提高生存竞争能力，从而加大杂草的防除难度^[7]。由于油菜属于常异花授粉植物，其花粉能够通过风媒或虫媒进行远距离的传播，有研究表明少量花粉能被传播大约3千米的距离，并且其活力不会因为距离的增加而降低^[8]。花粉活力的保持时间也较长，在室温条件下可以保持大约16天的时间，在温度低至3-5c时其活力能延长至大约30天^[9]。除了转基因油菜本身的花粉特点之外，在自然和农田生态环境中也存在着较多的野生近缘种，因此，人们对转基因油菜向野生近缘种的基因漂移格外关注。目前，已证实转基因油菜的抗性基因可以向芥菜（b. juncea）^[10]以及近缘杂草芜菁（b. rapa）^[11-12]、野芥菜（wild b. juncea）^[7,13]和野萝卜（raphanus raphanistrum）^[14-15]等发生漂移。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标

实验采用ssr方法，检测甘蓝型油菜c-染色体组特异片段在抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的回交的1代子5代（bc1f6）、2代子4代（bc2f5）、3代子3代（bc3f4）中的渗入情况，比较c-染色体组特异性片段在这两种转基因油菜与野芥菜的bc1f6、bc2f5、bc3f4中的传递规律及差异。

2 研究的内容

3. 研究的方法与方案

1 研究方法及实验方案

1.1 实验材料

供试实验材料见表1。实验所用材料获得的亲本抗草甘膦转基因油菜（DS-Roughrider，Roundup Ready，event RT73）和抗草丁膦转基因油菜（Swallow，Liberty Link，event HCN28），前者纯合并含有完整的cp4 epsps和gox基因及其各自的调控基因，后者纯合并含有1个pat基因。两种转基因油菜均来自于加拿大。野芥菜（wild B. juncea var. gracilis）采集于南京市江浦。

表1 供试实验材料

1.2 材料种植

实验材料种植于南京农业大学牌楼温室中。分别用草甘膦（1400 g a.i.ha^-1）和草丁膦（700 g a.i.ha^-1）对6叶期的抗草甘膦转基因油菜和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的BC1F6，BC2F5，BC3F4进行喷药筛选，再从经过抗性筛选后存活下来的植株中挑选生长健壮、大小适中的植株进行盆钵移栽。盆钵中所用土壤均为按1:1和腐殖质混合均匀后的菜园土，所用盆钵大小均为口径23cm，深24cm。每盆移栽一株，其中抗草甘膦转基因油菜、抗草丁膦转基因油菜、野芥菜各移栽20株，抗草甘膦转基因油菜和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的BC1F6，BC2F5，BC3F4各移栽60株。等到其长到8叶期程度时，分别采集抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的BC1F6，BC2F5，BC3F4的叶片，提取DNA。

1.3 检测方法

（1）PCR引物

表2 16对C-染色体组特异性引物

（2）SSR操作方法

① 聚丙烯酰胺凝胶配制

在两块洁净玻璃板之间夹入两片厚约1mm 的玻璃片，用琼脂封底，再按制胶的数量以合适的体积混合均匀40%聚丙酰胺，TEMED，10%过硫酸铵，5TBE溶液以及ddH₂O，倒入两块玻璃板之间，迅速插入梳子，等待胶凝固后将梳子取下，剥离封口用制胶槽和琼脂糖，将之安装在电泳槽上准备加样电泳。

② 点样

将约3μL的PCR产物点在点样孔中，在合适的点样孔中点样marker。

③ 电泳

点样过后用120V的恒压进行电泳。

④ 银染显色

电泳结束后将凝胶从胶板上剥离，在400mL的ddH₂O中加入约0.4g的硝酸银，用磁力搅拌器混匀后倒入装有凝胶的容器中，在摇床上摇动约20分钟。然后倒去其中的溶液，再将6g NaOH、0.076g四硼酸钠及1.6mL的甲醛均匀混合在400mL的ddH₂O中后倒入容器，再在摇床上摇10min后倒去其中溶液，加入合适容量的水方便捞胶。

⑤ 拍照

将胶平整放置在玻璃板上后在白光背景下拍照。

2 技术路线

3 可行性分析

本实验室已获得抗草甘膦转基因油菜和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的BC1F6、BC2F5、BC3F4的实验材料。

实验室已经具备从事SSR检测所需的基本设备和仪器，例如：PCR扩增仪、电泳仪、水浴锅、离心机、磁力搅拌器、天平、紫外分光光度计、冰箱、自动灭菌锅、摇床等。

在前期实验中，已对抗草甘膦转基因油菜和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的BC1F2-5、BC2F2-4、BC1F2-3的C-染色体组特异片段的遗传规律进行了检测分析，已经形成了成熟的实验方法，为本实验的顺利开展奠定了坚实的基础。

本人通过预实验，已经熟知了实验室已有C-染色体组上的16对特异性引物，并且熟练掌握了SSR检测方法，包括①聚丙烯酰胺凝胶的配制；②点样（每孔点3μL的样品）；③ 120V恒压电泳；④银染显色。故具备了一定的研究基础，为完成本实验提供了保障。

4. 研究创新点

前人尽管对C-染色体组特异片段在转基因油菜与野芥菜的回交1代和回交2代中的遗传规律进行过研究，但尚没有对在回交后代自交代中的研究报道。本实验以抗草甘膦转基因油菜和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的回交1代子5代（BC1F6）、回交2代子4代（BC2F5）和回交3代子3代（BC3F4）为研究对象，检测C-染色体特异片段在这些后代中的遗传规律，结合实验室前期的研究结果，明确随着自交代数的增加，C-染色体组特异片段在两种转基因油菜与野芥菜中的回交1代、回交2代及回交3代连续自交子代中的遗传规律，能为转基因油菜基因漂移的安全性评估提供多世代的检测结果。

5. 研究计划与进展

2016年08月-2016年09月：文献查阅，课题的资料收集和整理，学习实验方法。

2016年10月-2016年11月：种植并采集抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的bc1f6、bc2f5、bc3f4的叶片，提取dna。并通过预实验掌握ssr技术的操作步骤。

2016年12月-2017年01月：用16对特异性引物对抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的bc1f6、bc2f5、bc3f4的dna进行pcr扩增，并借助ssr方法对扩增产物进行检测，获得在抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的bc1f6、bc2f5、bc3f4中每条引物被检测到的百分率和单株平均检测到的百分率。