acrB基因功能的缺失对肺炎克雷伯杆菌抵抗胆盐的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.研究意义肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae）是人和动物肠道、呼吸道的条件致病菌。

易在患者的呼吸道和肠道定殖，在机体免疫力低下时，可引起呼吸道、泌尿道、消化道及皮肤软组织等多种部位感染。

近年来肺炎克雷伯菌成为医院内感染的主要致病菌之一。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标利用随机转座子插入肺炎克雷伯菌（kp2312）的基因组中，然后筛选出对胆盐不耐受或耐受能力弱的突变菌株。

对突变株的突变基因进行基因敲除，然后将基因敲除后的突变株与野生株进行生理性以及抗胆盐的实验，检测该基因对肺炎克雷伯菌抗胆盐的影响。

2.研究内容(1)随机转座子构建不抗胆盐的突变株将含有随机转座子的供体菌与肺炎克雷伯菌（kp2312）进行二亲接合实验，挑选出接合成功的菌株。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法1.1随机转座子构建不抗胆盐的突变株1.1.1二亲接合实验1.1.2筛选不抗胆盐的突变株1.1.3随机引物pcr(1)提取不耐受胆盐菌株的质粒(2)随机引物pcr（arbitrary pcr）(3)序列分析1.2敲除突变基因并构建基因缺失株1.2.1overlapping pcr(1)设计引物(2) overlapping pcr(3) 胶回收pcr条带1.2.2单交换菌株的构建(1)提取pwm91质粒(2)酶切酶连(3)电击转化(4)蓝白斑筛选转化成功的菌株1.2.3双交换菌株的构建(1)将重组质粒电击转换到接合型大肠杆菌sm10λpir中(2)将上一步的重组菌与受体菌vc6706 lacz-二亲接合(3) 二次同源交换(4) 蔗糖筛选1.3生理特性的测定(1)生长曲线的测定(2)杀菌实验(3)mic(4)毒力测定2.技术路线构建随机转座子突变体库筛选不抗胆盐的突变菌株确定突变基因并预测突变基因功能敲除突变基因检测敲除突变基因菌株的生理性状3.可行性分析3.1实验技术方法成熟指导教师在微生物与宿主间相互作用方面的研究中积累了丰富经验，实验技术方法成熟，已发表多篇相关文章。

本项目的研究计划已经划分，步骤详细切实可行，工作量适中。

3.2试验条件与设备齐全课题依托南京农业大学生命科学学院微生物与宿主间相互作用实验室，具备本项目实施所需的各种实验技术方法及实验设备，实验条件成熟。

4. 研究创新点

肺炎克雷伯菌是人和动物肠道、呼吸道的条件致病菌，能引起肺炎，败血症和尿路感染等疾病。

虽然近年来有大量关于肺炎克雷伯菌的研究报道，但是很少有对肺炎克雷伯菌抗胆盐机理的研究。

本研究采用随机转座子插入肺炎克雷伯菌基因组的方式构建突变体，能高效的构建突变体，并筛选出不抗胆盐的目标菌株。

5. 研究计划与进展

1.研究计划2017年10月-2017年12月 构建随机转座子突变体库并筛选不抗胆盐的突变菌株2018年1月-2018年4月 敲除目标基因2018年4月-2018年5月 生理特性的测定2.预期进展（1）筛选出不抗胆盐的肺炎克雷伯菌突变菌株。

（2）确定突变基因并预测突变基因的功能。

（3）敲除突变基因，构建基因缺失株（4）测定基因缺失株与野生型菌株的生理特性，包括在生长曲线， mic，杀菌实验等。