灵芝CreA的沉默菌株的构建及其特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 本课题研究意义随着常规化石油等不可再生资源日益枯竭，能源危机日益加剧，而利用好地球上极其丰富的可再生碳源纤维素这一课题正成为新的研究热点。

纤维素资源的利用主要是通过纤维素酶将其水解为葡萄糖来实现的，如何降低生产纤维素酶的高昂成本，则成为生物能源工业化的最主要难题。

微生物是很好的纤维素酶生产宿主，不过许多微生物在生产纤维素酶的过程中受到不同水平的调控作用并且伴随着其他物质的产出，从而其纤维素酶的生产效率被降低，导致生产成本增高。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标实现纤维素资源的有效利用的关键是获得高效、廉价的纤维素酶。

这就要求提高纤维素酶的催化活性及生产水平，筛选出新型高效的纤维素酶生产菌株。

深入阐明灵芝中碳代谢阻遏的调控机制，将有助于提高灵芝产纤维素酶的水平，加快新能源的开发与利用。

3. 研究的方法与方案

1 研究方法1) 通过与部分担子菌、子囊菌、动物、植物同源对比得到crea基因；2) 总rna的提取与cdna的制备以及荧光定量pcr；3) 根据cds序列设计引物pcr扩增目的基因；4) 用琼脂糖凝胶电泳法之后利用试剂盒对pcr产物回收；5) 化学法制备大肠杆菌感受态细胞以及转化；6) t-a克隆转化子的验证及测序；7) 碱裂解法提取质粒；8) 利用相关软件及网站对crea基因序列分析与结构域分析，查找保守氨基酸位点；9) 利用mega5.0软件构建系统发育树；10) 沉默载体的构建；11) 脂质体转化法转化灵芝原生质体；12) 不同碳源平板的生长实验；13) 荧光定量法测基因表达量以及数据处理和统计分析等。

2 技术路线见附件3实验方案3.1灵芝总 rna 的提取及 cdna 的制备3.1.1 菌丝体的收集得到灵芝hg菌株菌丝，液氮速冻， -70c 冰箱保存备用。

3.1.2 总 rna 的提取利用萃取、琼脂糖凝胶进行电泳等技术。

4. 研究创新点

界内关于CreA的研究近些年才逐渐增多，但对于在灵芝中的研究却仍然鲜有。

灵芝作为一个传统药物以及纤维素生产的优质菌株，对于其碳代谢调控的研究具有重要价值，本课题期望能够得到CreA沉默菌株，并与野生型做对照，得到CreA在灵芝碳代谢中的生理作用。

5. 研究计划与进展

2016.12至2017.01 克隆CreA；构建载体；提取总RNA并合成cDNA2017.02至2017.03 制备感受态并转化CreA表达质粒和cDNA文库质粒2017.04至2015.05 涂布筛选得到目的菌落，提取质粒后送公司测序分析，进行其生理特性的测定