粘质沙雷氏菌FS14磷酸转移酶系统的基因克隆和表达及表达蛋白的纯化开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

沙雷氏菌（serratia sp.）是一种在自然界中分布广泛的兼性厌氧菌，属于革兰氏阴性菌，水和土壤中的常居菌群，也是临床上常见的条件致病菌，可引起肺部感染等。

沙雷氏菌能产生多种胞外酶，在农业、工业和医药中都有重要应用。

细菌的磷酸转移酶系统（phosphotransferase system，简称pts）是一种多组分碳水化合物吸收系统，同时具有催化和调节功能。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：完成多个粘质沙雷氏菌磷酸转移酶系统（pts）蛋白质的克隆表达以及纯化。

基因编号为l085_ 05045,l085_05050，l085_04740，l085_04745。

用获得的蛋白进行结晶实验，研究其结构和功能，以及蛋白与蛋白之间的相互作用模式。

3. 研究的方法与方案

研究方法：1、pcr扩增目的基因；2、用酶切和酶连等方法将目的基因连接到pet28a等表达载体上；3、制备感受态细胞以及转化；4、在外源宿主大肠杆菌中诱导表达；5、亲和层析和分子筛层析方法分离纯化蛋白质；6、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定实验中获得的核酸和蛋白质；7、蛋白质晶体学研究和x射线衍射收集数据解析三维结构。

技术路线：（见附件）实验方案:1实验材料1.1 菌株沙雷氏菌菌株fs14、大肠杆菌dh5α、大肠杆菌c43（de3）。

1.2 表达载体pet28a，pet24b。

4. 研究创新点

1、磷酸转移酶系统在大肠杆菌中研究较多，而在沙雷氏菌中研究较少，本研究可以为后续深入研究沙雷氏菌磷酸转移酶系统奠定基础。

2、本实验室使用的粘质沙雷氏菌fs14是从病害的白术茎秆中分离得到的，能够分泌耐高温的dna酶和蛋白水解酶，这在沙雷氏菌中是首次发现，因此该菌株具有深入研究的意义。

3、本实验研究的几个沙雷氏菌磷酸转移酶系统蛋白质，其晶体学研究和三维结构还没有人解析，因此具有创新性。

5. 研究计划与进展

2017年10月 查阅资料、文献；向师兄师姐学习和熟悉基本实验操作；利用实验室已有条件进行实验。

2017年11月-2017年12月 l085_ 05045,l085_05050，l085_04740，l085_04745等各个基因的克隆及体外诱导表达。

2018年1月-2018年3月 分离纯化目标蛋白质，争取获得高浓度，高质量，稳定的产物。