酿酒酵母中SNARE蛋白Use1在细胞自噬过程中的定位研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

细胞自噬是细胞在面对内外环境压力时采取的一种维持自身稳定的机制[1]，它是真核生物中高度保守的一类亚细胞降解途径，它通过降解细胞内组分维持细胞内生理平衡并帮助细胞度过逆境。

细胞自噬发生后，能形成一种叫做自噬小体的双层膜结构，包裹细胞质和一些受损的细胞器，最终这些自噬小体与溶酶体（酵母中为液泡）发生融合，以完成对底物的降解[2]。

细胞自噬不仅是生物体内的一种物质降解途径，同时在生物体生长发育、免疫防御、细胞程序性死亡、肿瘤抑制、神经性病变抑制等方面有非常重要的作用[3]。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标通过对snare蛋白use1的研究，检测该蛋白在细胞自噬过程中的定位变化。

2 研究内容（1）克隆目的基因use1、use1-10aa至prs415-mcherry重组质粒。

将重组质粒转化到包含gfp-atg8的wt、atg1△、vps21△、ypt7△菌株及含有atg9-3xgfp的菌株中。

3. 研究的方法与方案

1 研究方法1.1目的基因克隆 提取wt和use1-10aa菌株总dna→pcr克隆目的基因→纯化pcr产物→第一次酶切→37℃培养3至4小时→纯化→第二次酶切→30℃培养3至4小时→酶连→转化至大肠杆菌→菌落pcr→双酶切验证，检测阴阳性→测序 1.2观察use1在细胞自噬中的定位用gfp标记atg8，便可以通过荧光显微镜观察atg8的运动，掌握细胞自噬的动态变化。

atg9被认为是一种膜载体，用荧光蛋白标记atg9便可以检测其在pas与外周膜结构之间的循环运动。

将克隆完成的目的基因转化入含有gfp-atg8或atg9-3xgfp的酵母菌株中，检测use1在细胞自噬过程中与atg8和atg9的定位变化。

4. 研究创新点

本研究初步地阐述调控内质网到高尔基体以及高尔基体内部的囊泡运输的SNARE蛋白Use1及Use1-10AA在细胞自噬过程的定位变化。

5. 研究计划与进展

2017年：09.1012.05 阅读相关文献，熟悉实验室仪器操作12.0512.31 撰写相关综述2018年：01.0301.22 Use1、Use1-10AA基因的克隆01.2202.02 荧光显微镜观察03.2004.30 撰写毕业论文