水稻类萌发素基因OsGLP响应重金属胁迫的转录调控初探开题报告

全文总字数：6142字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

在全球化发展过程中，工业污染物排放、采用污水灌溉等导致农田中重金属累积和超标，环境问题日益凸显，已经引起社会各界的高度关注。我国有10以上面积的耕地受到重金属污染^[1]，每年受到重金属污染的粮食多达1000万吨^[2]，而铜污染是土壤污染问题之一。铜污染不仅降低了土壤质量，而且不利于植物生长发育，威胁粮食安全。

类萌发素蛋白（germin-like protein，glps）是一类与小麦萌发素序列相似性较高的蛋白，它是位于胞外基质的可溶性糖蛋白。由于类萌发素含有β-折叠桶状结构域，可认为类萌发素与小麦萌发素均属于cupins超家族。几乎所有生物中均发现该类蛋白的存在。glps在不同物种所表达的蛋白质不同，在植物不同生长发育阶段以及不同的生物或非生物胁迫条件下表现出的生物学功能也不同，是一类极其重要的胁迫相应蛋白。

已经有许多研究表明glps在植物受到胁迫时参与生理调控。张宇航等^[3]发现gmglp10基因在大豆菌核病菌侵染下明显上调表达。张南南^[4]克隆获得一个新的岷江百合glp基因lrglp1，构建lrglp1植物超表达载体pcambia2300s-lrglp1转入烟草中过表达并培育获得t1代转基因烟草。正常生长情况下，转基因烟草叶片内sod和oxo活性显著高于野生型烟草。与野生型相比，lrglp1转基因烟草t1代种子和植株对干旱、nacl、镉胁迫及尖孢镰刀菌侵染的抗性都有所增强。胁迫处理诱使烟草叶片内sod、过氧化物酶(peroxidase， pod)和oxo活性增加，且lrglp1转基因烟草中这3种保护酶类的活性均显著高于野生型烟草。banerjee等^[5]对osglp1的定位进行研究，发现osglp1主要定位于细胞壁上，特别是在亚表皮细胞中的表达量较高。这个结果说明当水稻受到病原侵染时，glp大量表达，产生的h₂o₂使初生细胞壁中的木聚糖交联，来维持结构稳定。因此，当植物受到非生物逆境胁迫处理时，植物体内的部分glps将发挥其结构蛋白的功能，保护植物渡过不利的环境条件，降低外界不利条件对植物的影响^[6]。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标

1、明确重金属胁迫对osglp基因的诱导表达特性；

2、重金属胁迫下，筛选并鉴定调控osglp基因表达的上游转录因子种类及其功能。

3. 研究的方法与方案

1、 分析水稻OsGLP8-7的转录调控情况

（1）构建OsGLP8-7的GUS组织化学定位材料。

（2）检测重金属胁迫下GUS活性，分析OsGLP8-7目标基因启动子在重金属胁迫下的不同组织器官的活性，进而明确铜胁迫下OsGLP8-7的转录调控情况。

2、筛选OsGLP8-7的转录因子

（1）依据实验室先前已经完成的Cu-IMAC-MS水稻蛋白质组学实验，选择OsGLP8-7为靶基因，利用酵母单杂交技术，以克隆的OsGLP8-7启动子顺式作用元件为诱饵，筛选出与其互作的转录因子（TF），进一步分析其转录信号调控途径。

（2）根据上述筛选结果，通过原核表达获得纯化的转录因子蛋白，进行凝胶迁移实验（EMSA）验证转录因子与OsGLP8-7的互作关系。

（3）通过荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）进一步验证转录因子与OsGLP8-7的互作关系。

3、分析水稻中OsGLP8-7的转录因子表达模式

（1）克隆转录因子基因，将转录因子蛋白分别与sGFP的N 端和C 端融合，通过基因枪导入洋葱表皮细胞或转染水稻原生质体，进行瞬时表达，明确其亚细胞定位。

（2）采用qRT-PCR技术，检测该转录因子在转录水平上的表达丰度。

4. 研究创新点

1、GLPs具有超氧物歧化酶（SOD）作用，其在水稻响应重金属中的作用可能与水稻的抗氧化防护有所联系。

2、本研究选取上游转录调控角度，试图揭示GLPs在水稻响应重金属中的作用。

5. 研究计划与进展

2018年9月-2018年10月：检测重金属胁迫下osglp8-7的gus活性

2018年11月-2019年4月：筛选osglp8-7的转录因子。

2019年5月-2019年6月：整理实验数据，攥写毕业论文，准备答辩。