利用CRISPR/Cas9技术构建拟南芥MBD5/6基因突变体开题报告

全文总字数：9065字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

crispr/cas9技术是从古细菌或细菌体内一种天然的能够抵御外源dna侵入的获得性免疫系统改造而来的新一代基因组编辑技术。该技术不同于传统的基因编辑手段，仅需通过设计一条特定的sgrna序列，靶向特定位点，在目的dna序列上造成双链dna断裂（double strand breaks, dsbs），从而激活细胞自身修复系统的非同源末端连接（non-homologous end joining, nhej）途径, 对损伤处dna进行修复¹，由于这种修复的错误率很高, 因此可实现对目的基因组位点的高效精确靶向编辑. 此系统具有操作过程简单、适用性广，成本低，突变效率高的特点, 因此被广泛地应用在生物学的研究和应用领域。典型的crispr结构由若干个20~50bp的高度保守的正向重复序列（repeats）和有着近似长度的非重复间隔序列（spacers）串联组成，在crispr位点附近还存在着4~10个保守的crispr相关基因（crispr-associatedgenes, cas genes）²。cas基因参与crispr天然免疫防御途径，常与crispr基因相连。cas蛋白具有一个核酸相关的结构域，通过位点特异性的切割使靶dna序列被切断。在cas基因和crispr位点间有一个前导序列（leader sequence）,可作为启动子，转录crispr序列³。cas基因有着丰富的多样性，是一类大的多态性基因家族，结合特征蛋白家族的分析和cas基因位点结构的特征，crispr/cas系统可以分为两大类（class1和class2），6种不同的类型（type i ~ type vi）⁴。crispr/cas9系统属于class2类typeii型系统，其仅需要一个cas9蛋白即可完成免疫过程，是目前改造及应用最为广泛系统。

crispr/cas系统的特异性识别并将靶标dna切断，有利于激活机体自身的nhej修复机制，很好地满足了基因编辑工具的要求。crispr/cas9系统设计成新一代基因编辑工具的基本原理为将crrna-tracrrna改造成5’端为靶标片段互补序列3’端为tracrrna的sgrna(single guiderna)。自2013年mit feng zhang和哈佛大学george church首次利用crispr/cas9技术在哺乳动物细胞中实现基因编辑^5,6以来，crispr/cas9技术已被应用于基因表达调控、高通量筛选、动物疾病模型构建等多个领域。同时针对crispr/cas9系统本身，研究人员也进行了深入的探索，改造野生型spcas9蛋白，开发出了dcas9⁷（deadcas9），用于基因表达调控，建立crispri⁸（crisprinterference）及crispra⁹(crispractivation) 技术；针对cas蛋白的体积及靶向切割效率改造出了sacas9和xcas9等。相比于zfn和talen，crispr/cas9技术只需设计sgrna即可实现对靶dna的编辑，操作简单，且cas9蛋白的pam序列为ngg（n可为任意碱基），靶向效率高且通用性好，同时crispr/cas9技术还可实现对多位点的同时编辑，这些使得crispr/cas9技术迅速成为新一代主流的基因组编辑技术。

crispr/cas9技术因其简便的操作，编辑效率高，靶向精确度好等特点而被广泛引用于在生命科学的各个领域。自feng zhang研究组首次报导利用crispr/cas9技术分别对人细胞293t和小鼠细胞nero2a的基因完成定点突变以及harvard的georgem church研究组完成对哺乳动物细胞的定点基因编辑以来，crispr/cas9技术已成功应用于大肠杆菌¹⁰、酿酒酵母¹¹、小鼠¹²、斑马鱼¹³、线虫¹⁴、大鼠¹⁵、人细胞系¹⁶等多个不同物种中。在植物的基因组编辑方面，crispr/cas9技术也有很大的突破，2013年8月，nbt同期报道了三家实验室在拟南芥、水稻、小麦以及本生烟上成功应用crispr/cas9技术进行基因编辑操作^10,16,17。此后，在高粱¹⁸、甜橙¹⁹、玉米²⁰等多种植物上相继报道了应用crispr/cas9技术成功进行基因编辑。

2. 研究的基本内容和问题

（1）研究目标

利用crispr/cas9技术构建拟南芥mbd5/6突变体。

3. 研究的方法与方案

1)拟采取的研究方法

pcr、酶切酶连、琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、大肠杆菌转化、质粒提取、农杆菌转化法、基因克隆、农杆菌浸染法转入目的基因、ctab法小量提取dna、拟南芥种子消毒播种

2)技术路线

4. 研究创新点

（1） CRISPR/Cas9基因编辑技术在动物方面的应用非常成熟和广泛而在于植物体中的正处于快速发展当中。

（2） MBD蛋白家族与植物甲基化有着非常密切的关联，之前的研究报道中有人提出MBD5、MBD6两个蛋白可能参与DNA的去甲基化，本实验创新地使用CRISPR/Cas9技术构建拟南芥MBD5、MBD6基因突变体研究模型。

5. 研究计划与进展

（1） 2018.7-2018.8

查阅文献资料，了解实验方法，准备实验材料及实验试剂。

（2）2018.8-2019.10